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Eric Lader, Ph.D elader@ambion.com Marketing Product Manager Manager, Product Applications Group Agenda Sample prep considerations •

General notes: Consistency is crucial to the accuracy of QRT-PCR, so the extra steps in this protocol are necessary. In general, be extra c

1.定量PCR的实验要素 目标基因 未知样品 生成标准曲线 标准品梯度 监控系统故障 阳性对照 监控污染 阴性对照 校准生物学误差 管家基因(IPC) 校准物理误差 参比荧光(ROX) 降低其余误差 重复实验96孔板设置举例样品标准品目的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数

在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在

1.随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。2.Oligo dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不

实验材料： 水稻叶片的 RNA 。 实验原理：目前 PCR 技术只能扩增 DNA 模板，对 RNA 模板不能直接扩增。mRNA反转录生成的 cDNA 可作为 PCR 的模板进行扩增，这种在 mRNA 反转录后进行的 PCR 扩增称为 RT-PCR 。 RT-PCR 比 Nor

目前已有多种方法用来研究有关细胞和组织中，基因表达产物方面的内容，这些方法主要有Northern印迹、RNase保护分析法、原位杂交、点印迹、Ｓ１核酸酶分析法及反转录与PCR扩增串联的RT-PCR技术等。在这些方法中RT-PCR技术具敏感度高和应用范围广的特点，该技术提供给研究人

反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定，所以近年来RT-PCR技术被广泛应用于人和动物的多种传染病早期诊断

RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) is the most sensitive technique for mRNA detection and quantitation currently avail

一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白） 共合成109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常