RT-PCR引物的选择

1.随机引物>>>适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。
2.Oligo dT>>>适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。
3.基因特异性引物>> 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性 引物连用。

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异

性扩增带与非特异性扩增带。

 

原因		建议
引物	引物特异性差	重新设计引物，改变引物的位置和长度，增强其特异性或使用巢式PCR
	引物浓度过高	适当减少引物浓度
Mg2+浓度	Mg2+浓度过高	适当降低Mg2+浓度，从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
耐热聚合酶	酶量过多	以0.5U为间隔适当减少酶量
退火温度	退火温度过低	适当提高退火温度或采用二阶段温度法
PCR循环次数	PCR循环次数过多	减少PCR循环次数

 

4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管