细胞是生物活动的基本功能单位，也是生命科学的核心研究对象。单细胞测序技术自2009年问世，是在单个细胞水平上，对细胞基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术；随着近年来二代三代基因测序技术的迅速发展，测序通量逐渐提高，测序成本逐渐下降，这为单细胞测序的发展提供了一片沃土，使其成为生命科学里一个非常活跃的研究领域，更多地被应用到基础医学和临床转化的研究中。
在不久前举办的《第二届单细胞测序技术高端研讨会》上，生物探索有幸采访到了现任北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、生命科学学院研究员——白凡，并聆听他分享了他和团队在近些年将单细胞测序应用于癌症研究上的成果与体会。匆匆采访，严谨、谦逊和亲切是白凡研究员给人的最初印象。
北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、生命科学学院研究员
名校学子，回报母校
据了解，白凡早前毕业于北京大学物理系，在远赴英国牛津大学攻读并取得博士学位后，他曾先后在牛津大学和大阪大学（日本）进行过博士后研究。2011年，满载着国外留学和科研工作中积累的丰富学识和经验，白凡选择回到母校任职，并先后承担多项自然科学基金委、科技部和北京市科委的科研项目。在北大工作期间，白凡研究员和团队一直致力于通过对癌症病人外周血循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）进行单细胞分析，深入探索癌症转移的分子生物学机制以及实现无创癌症诊断、预后判断、疗效评价的临床方法。
近年来，他们已经利用单细胞测序技术在CTC、肿瘤异质性及克隆起源等课题上取得了重大突破和进展。他们在世界范围内第一个报道了单个CTC的全基因组测序结果并获得广泛关注 （PNAS，2013）；他们通过单细胞基因测序分析了结直肠癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌以及肝癌等不同癌种中CTCs的特征与差异，进一步揭示了肿瘤转移的分子机制和克隆起源等问题，具有重要的科学意义和临床价值（Genome Research，2017）。近期，白凡研究团队又把研究重点转到了小细胞肺癌上，通过CTCs实现对小细胞肺癌肿瘤突变特征的无创探测和病人化疗敏感性的预测（Clinical Cancer Research, 2019）。
循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移中的中介作用
如今，CTCs的定义已经比较明确——它们是以不同形态存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团（CTM，Circulating Tumor Microemboli）。它们源于自发或临床诊疗操作中从实体肿瘤病灶（肿瘤原发灶或转移灶）的脱落，能够越过组织间基底膜并入侵组织基质，从而进入血液循环系统。
“现在，我们对癌症转移的关键步骤已经有了比较清晰的认识，而CTC在癌症转移中起了关键的中介作用”白凡研究员介绍道，“当这些CTCs进入到血液循环系统后，它们就会沿着血液快速地扩张到其他身体部位。虽然这一过程中大部分CTCs会发生凋亡或被吞噬，但少数能够逃逸并存活。一旦这些逃逸的CTCs在一些其他组织的毛细血管里停留下来，就会启动另一过程离开毛细血管去重新建立和发展成为新的转移灶。这大大增加了恶性肿瘤患者的死亡风险。”
事实上，早在一个多世纪前（1869年），澳大利亚籍医生Thomas Ashworth 就在癌症病人中首次观测到了CTC。他发现病人外周血中一些异常形态的细胞与癌细胞非常相似，于是提出了这样的猜测：那些异常形态的细胞是否与癌症的广泛多器官转移有着直接的关系呢？ 遗憾的是，当时Thomas Ashworth无法提取CTCs来继续追踪它们的“来龙去脉“。
研究者多年来都希望能够从病人外周血中捕获CTCs来进行更有效的研究，但这一细胞群体的数量十分稀少，而且混杂在大量的血细胞之中。条件和技术的限制使得CTCs的研究一直受阻。白凡研究员解释说：“正常人1m l血液里大概有1亿血红细胞，100万左右白细胞。然而在一毫升癌症病人血液里，往往只能分离到几个到几十个CTC s。因此，捕获和分离CTCs去进一步研究是一个十分有挑战的难题。”一些研究也表明：1 g肿瘤组织，大约有100万个肿瘤细胞，可每日播散肿瘤细胞进入血液。然而CTCs的数量在循环血液中常呈现出动态递减的特点，到达外周血时已十分稀少。
单细胞测序技术鉴定和表征循环肿瘤细胞（CTCs）
直到近些年，对细胞富集、分离和鉴定分析等新技术的快速发展以及测序技术的飞跃重新点燃了CTCs这一领域的研究，让CTCs作为一种临床中切实可行的肿瘤评估方法逐渐变成可能。白凡研究团队最早关于CTCs的研究是从分析肺癌病人CTCs的基因组拷贝数变化 （copy number variation-CNV）模式和点突变开始的。现在已经有很多的不同的方法来分离CTCs，他们主要通过目前唯一经美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于检测CTCs的Cell search平台来获取和分离单个CTC，并对其遗传物质进行扩增和全基因组测序。这一突破性结果发表在2013年《PNAS》上，并在同年《Nature Methods》特别报道中（singled out for sequencing ）得到重点引用。
在分析了CTC单细胞全基因组的CNV模式并将该数据与相关实体肿瘤平行数据进行比较后，白凡研究团队发现CTCs与原发位和转移位肿瘤中存在明确的基因共同区域的缺失与扩增，而且来自同一病人CTCs 的CNV 模式具有一致性。同时，同一亚型的肺癌患者中，CNV模式在肺癌发生发展的重要区域存在明显的相似性（如：第8号染色体的后半段有明显扩增）；而在不同亚型的肺癌患者中 （如肺腺癌和小细胞肺癌），CNV呈现出了不同的模式。白凡研究员总结道：“这提示可以对外周血CTCs进行全基因组CNV检测，根据CNV推测肺癌的不同亚型。”
2013 《Nature Methods》上 singled out for sequencing 特别报道
不仅如此，白凡研究团队还通过CTCs基因测序在肺腺癌向小细胞肺癌转化的患者中发现，癌症治疗中产生的耐药性与特定抑癌基因的点突变具有明确相关性。结合病理判断，他们进一步验证了在产生耐药性后癌症能够以CTCs为途径从肺部原发灶向肝部形成新的转移灶。“这些结果说明，对CTCs的分析可以帮助获取病人的靶向用药、耐药、表型转换等临床非常关联的重要信息。”白凡研究员这样评价。另外，他们还通过外周血CTCs基因测序观测了癌症治疗中不同时间点 （如化疗前、一线化疗和二线化疗）所发生的点突变，来探知肿瘤克隆的演化过程。
在已有的肺癌研究基础上，白凡研究团队又将分析经验应用到其它中国人高发的癌症中，如：对胃癌和乳腺癌进行分型、预测前列腺癌激素治疗效果，鉴定结直肠癌转移的关键标志物等。他们将多个癌种的研究结果汇总，进行了跨癌种综合分析，特别关注了与癌症转移驱动时间相关的CNV变化，相关结果在2017 年发表在《Genome Research》 上。
从单细胞层面理解肿瘤细胞异质性和克隆起源
伴随生命科学认识的深入，研究者们越来越多地发现同一组织的细胞之间或同一类型的细胞之间事实上存在着不同程度的差异，这些差异被称为细胞间的“异质性”。在许多生命活动的关键问题上，单个细胞所发挥的作用其实是非常重要的，如在胚胎发育，肿瘤，不可培养微生物等的研究上。
肿瘤中的单个细胞间可以存在很大程度的差异，高度异质性的细胞对癌组织的表型有高度的塑造作用。白凡研究员认为，肿瘤的异质性是肿瘤在发生发展的长期演化过程中，不同的肿瘤克隆之间存在相互竞争的情况下产生的。这种细胞间的异质性对现在的肿瘤治疗带来了很大的挑战。
传统研究依赖于群体细胞测量，通常把同一组织或同一类型的大量细胞作为研究对象，会掩盖单个细胞之间的差异，因此具有局限性。白凡研究员表示，现在有了单细胞测序技术，就可以以单个细胞的精度去研究。如果再结合生物信息学的方法，就能够准确地把整个肿瘤的异质性和它的演化历史以最高的精度去重现。白凡研究团队利用单细胞基因测序的结果构建了进化树，并分析了肝癌不同亚型以及混合型肝癌的异质性。此外，他们还发现了混合型肝癌中不同克隆间独立和共同起源并存的情况并推测了其可能的转移路径。相关结果于2019年发表在《Cancer Cell》上。
世界肝癌分布（A）、肝癌发病位置(B)和肝癌异质性(C) （Xue et al., 2017）
近期有一些研究表明，癌症耐药性与不同药物作用下细胞的异质性反应有关。对此，白凡研究员也给出了自己的看法：“癌症的耐药性确实是一个非常复杂的问题。除了研究肿瘤细胞本身，对于免疫细胞和其它对肿瘤的发生发展有很大促进作用的因素也要深入研究和理解。因此，可从两个方面去考虑：第一个是遗传层面。也就是说肿瘤细胞发生了基因型的变化，产生新的基因型来适应药物的处理以存活下去；另一方面就是非遗传层面，像是复杂的肿瘤微环境所带来的影响会增强肿瘤的耐药性，又或者是肿瘤的表型上的一些改变，比如有些肿瘤细胞能够将一些化疗药物有效地排出来，可以称之为‘外排泵’作用，不让它对肿瘤细胞进行杀伤。这同样会增强它的耐药性。
对未来癌症治疗药物的研发，白凡研究员也谈论了一些展望。具体来说，传统的大量样本研究只针对一些重要的基因突变，伴随着技术的进步，未来的癌症治疗还是有很多的潜力。现在有了单细胞精度的癌症研究，研究人员就可以对肿瘤细胞里面一些特殊的群体，比如像肿瘤干细胞或是同时具有多种表型的肿瘤细胞，又或是对肿瘤微环境中帮助肿瘤生长的细胞类群及其它因素，进行更深入的研究和理解。这些新知识的获取会带来一些新的药物设计的思路，展开一些新的癌症研究领域。
