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一、准备工作 1、实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）EP管1。5ml、100ul （4）水浴箱 2、实验器具的处理与准备 塑料制品：（包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪

临床血液学杂志 2000年第4期第13卷 临床研究 作者：韩艳秋　杨海萍　邰秀珍　杨殿相 单位：韩艳秋（内蒙古医学院附属医院内科呼和浩特，010059）；杨海萍（内蒙古医学院病理生理教研室）；邰秀珍（内蒙古医学院附属医院内科呼和浩特，010059）；杨殿相（内蒙古医学院病理生

第一部分 RNA 提取策略 1、RNA降解的原因内源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因为人体细胞自身就是几十分钟（20min？）mRNA被降解一轮，所以不管是组织还是细胞还是液体状样本在离开其中细胞的最佳生活状态后都应该尽快的被妥善的方法保存起来。外源性RNA酶也是

PCR基础 聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察

原位聚合酶链式反应（in situ PCR）和原位反转录聚合酶链式反应（in situ RT-PCR）操作规程 （一）、仪器设备 英国Thermo Hybaid原位PCR仪。 （二）、操作流程 1、原位PCR步骤 1）预处理： （1）切片常规脱蜡； （2）0.2mo

材料： （1）急性期病人血清、鼠肺、鼠血或分离的汉坦病毒 （2）引物： 引物 序列（5’～3’） 位置 片段（bp） 逆转录引物 TAGTAGTAGACTCC 1~14 LMS 通用外引物 AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG 19

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA

RT-PCR简介 RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直

常见问题可能原因建议解决方案少量或没有RT-PCR产物RNA被降解分离无污染，高质量的RNA；提取RNA的材料要尽量新鲜，防止RNA降解；RT反应前，在变性胶上分析RNA的完整性；RNA提取后，应储存在100％甲酰胺中， 如果使用RNase抑制剂，加热时小于45℃；pH小于8.

摘要 RT－PCR 已经成为研究者确定感兴趣的器官、组织或细胞中mRNA 转录本出现、结构和表达水平的基本方法。RT－PCR的基本步骤包括：首先对样品中出现的所有mRNA 合成一个cDNA拷贝，接着扩增感兴趣的基因。因为两个步骤中使用的反应缓冲液不能兼容，所以这两个步骤（RT