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常见问题
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可能原因
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建议解决方案
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少量或没有RT-PCR产物
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RNA被降解
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分离无污染，高质量的RNA；提取RNA的材料要尽量新鲜，防止RNA降解；RT反应前，在变性胶上分析RNA的完整性；RNA提取后，应储存在100％甲酰胺中，>如果使用RNase抑制剂，加热时小于45℃；pH小于8.0，否则抑制剂会释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM>DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。
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逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐等；将对照RNA和样品混合，与对照RNA反应比较产量，以检验是否有抑制剂；通过70％乙醇对RNA沉淀进行清洗，除去抑制剂。
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确定退火温度适合实验中所用的引物，对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟；对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。
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增加RNA的量。对于小于50ng的RNA样品，>可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg－0.5μg乙酰BSA。
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尝试其他组织
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对两步法RT-PCR，在PCR步骤中的cDNA模板不能超过反应体积的1/5
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产物有非特异性条带
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引物和模板的非特异性退火
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避免引物3'端含有2－3个dG或dC；在第一链合成中使用基因特异性引物，而不是随机引物或oligo(dT)；在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度；使用热启动Taq DNA酶进行PCR，提高反应的特异性。
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遵循用于扩增引物设计的同样原则
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使用扩增级DNaseⅠ处理RNA；设置没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
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设计在3'端没有互补序列的引物。
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对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
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使用抗气雾剂的吸头和UDG酶
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产生弥散（smear）条带
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第一链产物的含量过高
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常规PCR反应步骤中减少第一链产物的量
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PCR反应中引物过多
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减少引物的用量
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循环数过多
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优化PCR反应条件，减少PCR的循环次数
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退火温度过低
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提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸
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Dnase降解DNA是产生的寡核苷酸片段产生的非特异性扩增
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提取高质量RNA，防止被DNA污染
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