| >目标基因 | >未知样品 |
| >生成标准曲线 | >标准品梯度 |
| >监控系统故障 | >阳性对照 |
| >监控污染 | >阴性对照 |
| >校准生物学误差 | >管家基因(IPC) |
| >校准物理误差 | >参比荧光(ROX) |
| >降低其余误差 | >重复实验 |
样品
标准品
数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA
也可以使用不同的：PCR产物、质粒、病毒、人工合成片段……
PCR效率一致，且接近100%
•仪器一致
•反应条件一致：循环参数、同一次实验
•试剂质量一致：模板、引物和探针Tm值、酶及缓冲液
梯度稀释方法
选择目标、提取/PCR、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释
CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间
10倍连续梯度稀释方法：
1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii
1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii
1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv
1v 标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
切不可由标准品I分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v
注意测定对单位的要求
如果要求测定样品的基因拷贝数，→梯度稀释已知摩尔浓度的DNA片段
如果要求测定样品的重量百分比[%(w/w)]，如转基因，标准品是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合，然后抽提混合DNA；切不可先抽好转基因DNA，再梯度稀释，也不可分别抽提转基因与非转基因DNA，再按重量比例混合（这样得出的是基因重量百分比，而不是样品重量百分比）
PCR效率对定量结果的影响
•标准品DNA与目标DNA必须是一样的吗？
•当检测多个基因时，需要分别做标准曲线吗？
做几条标准曲线？
Relative Standard Curve
Comparison of the c-mycexpression level in brain, kidney, liver and lung
Standard: Raji Cell line total RNA
Endogenous Control: GAPDH
管家基因—IPC
�通常以uL或者ug为单位取样通常以uL或者ug为单位取样
细胞培养液：同样体积，细胞数目并不同样
DNA溶液：抽提效率和操作误差，同样体积的DNA并不来源于同样数目的细胞
copy/uL 要校正成copy/cell才有意义
IPC 的定义
••什么是什么是IPCIPCIPC通常选用管家基因它与目标基因在相同的PCR条件下具有相似的扩增效率
••IPCIPC 的作用的作用监控PCR抑制物、DNA/RNA提取的损失、操作误差等对定量数据的影响，并对以上原因造成的定量误差进行修正。
IPC 的选择标准
-在所有待测样品中，内对照(Endogenous Control)的表达量都恒定不变
-注意所选基因是否是组织依赖的、发育阶段依赖的、或者处理方式依赖的
-多重定量时，内对照的表达量最好比目标基因高
-推荐使用Human Endogenous Control Plate (P/N 4309920)测试不同管家基因的效果
-常用的内对照有18S rRNA、β-actin、GAPDH等
•在使用TaqMan MGB探针的情况下，你认为管家基因与目标基因是在同一管内做多重定量好，还是分成两管分别定量好？哪一种检测的数据更精确？
