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引物设计基本原则 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpi

一、设计原理 1.选择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。 2.长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15-20bp. 3.Tm值：引物的Tm值一般控制在55-60℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2

1． Oligo DNA是以OD260单位来计算的，这是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为 1A260的Oligo溶液定义为1 OD260单位，根据此定义，1 OD260单位相当于33μg的 Oligo DNA，您可以根据此数据和您的Oligo DNA

主要内容 背景 PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线Primer3 介绍 PCR 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来

1 功能基因克隆的基本策略 ① 根据已知的脊椎动物某一特定基因的氨基酸序列的保守区域设计简并引物，利用RT-PCR技术获得该基因的核心片断，将该片断分离纯化后与T载体连接，转化大肠杆菌，挑取白色菌落，经 PCR反应鉴定得到阳性克隆，送阳性克隆的PCR产物去测序，从而获得目的基因

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。

在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。 Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.0的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。 “Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是

在聚合酶链反应(PCR)的方法建立以前，面院DNA长链上某种基因的变化有很大难度。1983年由Kry Mullis 等利用当时已经发现的DNA聚合酶，首先建立的体外DNA序列扩增法，基本方法是用寡核苷酸引物扩增位于两个已知序列之间的DNA序片段。反应在DNA聚合酶催化下完成。引物

引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 1、典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列

标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 　 10ul 4种dNTP混合物 　 各200umol/L 引物 　　　　 　 各10～100pmol　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　 Mg2+ 　　　　　　 1.5mmol/L