引物设计基本原则
引物长度（primer length）
产物长度（product length）
序列Tm值 (melting temperature)
G+C含量（composition）
引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）
阅读框
1. 引物的长度
一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度
2. 产物的长度
扩增片段长度为100~600碱基对.
3. Tm值
引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.
Tm=2(A+T)+4(C+G)
4. 引物的GC含量
有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物自身
引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败
任务
用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1
引物要求
PCR扩增GFP
GFP两边添加BamHI酶切位点
保证NR1的阅读框不改变
第一步：扩增GFP基本序列
第二步：GC比值；Tm值
第三步：酶切位点
第四步：阅读框
第五步 保护序列
Primer1: 5’ GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
Primer2: 5’ GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
