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PCR产物的克隆(平头连接和粘头连接)
PCR产物克隆大致分为两类,即平头连接和粘头连接。 平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头;PCR 产物纯化后,可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min(利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚
2010-08-12
原核表达之目的基因克隆
1. 了解实验课题对目的蛋白的要求 包括:目的蛋白分子量有多大,表达目的(是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体,不同目的对蛋白要求不同);是否要其可溶;是胞内表达还是分泌表达,是组成型表达还是诱导型表达;另外,还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化,纯化标签有多大,蛋白纯
2010-03-05
TA克隆常见问题分析及其解决方案
问 题 可能的原因 建 议 转化后无克隆菌产生 转化过程有问题或感受态细胞失活 可通过转化pUC18/19等未切割的可用于抗性筛选的质粒,检测感受态细胞的转化效率和转化操作是否正确 插入对照DNA片段的阳性率低 10×快速连接缓冲 液稀释不当 提供的
2010-03-05
PJB’s hints for sub-cloning
1)Prior to any ligation reaction,you should always run one gel in which purified insert and cut backbone are run side by side,preferably bes
2010-03-05
重组质粒(dna recombinant plasmid)的连接
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA 片段( <10kb) 且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段,然后体外使两者相连接,再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在
2010-03-05
基因克隆:高效感受态细胞制作
方法一 A液:1M,MnCl2: B液:1M,HEPES,pH=6.2-6.8,用无菌水配,配后不需灭菌; C液 称取CaCl2 0.10g,KCl 1.18g,全部转入细口试剂瓶,然后加入46ml三蒸水,轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎,然后放入
2010-03-05
Cohesive End Ligation
1) The ligation mixture contains the following: vector (~100 ng) insert (equimolar or 2 or 3 X molar concentration of vector) water a
2010-03-05
Self-circularization of Linear DNA
一、In a microcentrifuge tube prepare a solution of linear DNA (25-50ng) in deionized water or TE buffer (10-35µl). 二、Add: (一)10X ligation b
2010-03-05
24h Subcloning Protocol
The following protocol is designed for subcloning inserts (I) from one vector into another vector (V). The inserts can be anywhere from 30
2010-03-05
纯合克隆筛选
1.融化杂合突变ES细胞 ,ES/LIF培养液培养,每2~3天传代,实验开始把细胞 接种到三个100mm铺有凝胶碟皿中,每皿接种1~2×106 细胞 。为筛选需用一个以上的ES杂合突变细胞系,因不同细胞系的转化效率不全相同,另外对检测细胞表型也需如此。 2.每皿细胞分别加入1.
2010-03-05
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