CRISPR-Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins）系统已被广泛用于许多不同生物体的基因组工程和转录调控，一系列报道证明基于转录激活因子与CRISPR-Cas系统的效应蛋白融合，可以实现对內源基因的转录激活，并开发出了多种类型的转录激活工具CRISPRa（CRISPR activation）【1-4】。CRISPR特异的转录调控工具可以通过调节基因的表达而不会造成永久性的DNA损伤，不会产生有害突变和脱靶效应。在临床上，其可以通过同时调节多个基因活性来提供更好的治疗效果，弥补基因治疗存在的不足。但以CRISPRa为代表的基因调控平台因为转录激活效率低下，通常需要融合多种蛋白组件，进而导致其大小超过AAV递送系统的包装极限，极大地限制了其在体内基因治疗中的应用。因此，亟待开发作用效果更强、作用元件更简洁的基因转录调控工具。
近年来，相分离对转录的调控研究已经越来越被大家所关注，如转录因子及RNA聚合酶Ⅱ可通过多价互作介导的相分离机制在启动子位点聚集，促进高效的基因转录起始和延伸【5-9】。那么利用CRISPRa系统与相分离蛋白融合，相分离蛋白是否可以通过介导多价互作使CRISPRa在靶位点浓缩聚集，从而实现基因转录的高效激活呢？这是一个值得探讨的科学问题。
近日，中山大学生命科学学院的松阳洲教授团队及微光基因（苏州）有限公司团队在Protein & Cell杂志发表题为CRISPR-assisted transcription activation by phase-separation proteins的文章，首次将dCas9-VPR（VP64-P65-RTA）转录激活系统与相分离蛋白的IDR（intrinsically disordered region）融合, 证明相分离蛋白辅助的CRISPRa系统可以显著提高哺乳动物细胞中內源基因的表达激活效率，并且该系统具有更宽的gRNA设计窗口（转录起始上游>200 bp）及更低的DNA链靶向偏好性，同时也具有较高的靶向特异性。该研究为精准靶向的转录调控工具的开发与优化提供了新思路；开发的高效转录激活工具在大部分靶位点优于现有激活工具，且作用元件更为简洁；在遗传疾病的治疗应用方向有很大潜力。
dCas9-VPR系统单独起作用时， DNA结合位点只能结合有限拷贝数的VPR，但当dCas9-VPR与相分离蛋白融合后，可以通过相分离蛋白介导的弱多价相互作用募集同类蛋白，使靶位点结合的VPR拷贝数极大提高，从而更高效的激活基因表达（图1 A）。因此，研究人员把dCas9-VPR与不同的相分离蛋白融合表达，发现不同的相分离蛋白都能使dCas9-VPR的转录激活效率得到提高（图1 B-C）。其中dCas9-VPR-FUS IDR融合蛋白在不同靶基因中都能有显著转录激活效果，且融合蛋白更小，因此研究人员后续研究集中在dCas9-VPR-FUS IDR融合蛋白，并简称为dCas9-VPRF系统。
图1
随后，研究人员进一步研究了dCas9-VPRF系统的转录激活特性，在不同靶基因的上游设计了多对gRNA并分别检测靶向链和互补链的激活转录水平。与dCas9-VPR进行对比，发现在多个位点中dCas9-VPRF系统的转录激活效率都更高，并且dCas9-VPRF系统具有更宽的gRNA设计窗口（转录起始上游>200 bp）及更低的DNA链靶向偏好性。
为了测试dCas9-VPRF系统与其他高效CRISPRa（SAM, SUN, SPH）系统的差异，研究人员对比了在同一基因位点上各个系统的转录激活效率，发现在大部分检测的位点中dCas9-VPRF系统也具有更高的转录激活效率。
最后，研究人员进一步探究了dCas9-VPRF系统的靶向特异性, 通过表达谱数据分析发现：dCas9-VPRF系统与dCas9-VPR的特异性相当，在高效激活目的基因的同时具有较好的靶向性。
综上所述，该项工作证明了相分离蛋白融合CRISPRa系统可以使转录激活效率进一步提高，为CRISPRa工具的开发提供了新思路。该项研究开发了新型相分离蛋白辅助的转录激活工具dCas9-VPRF，相比现有的CRISPRa系统具有更高的转录激活效率和gRNA设计窗口，且具有较高的特异性。该研究拓展了CRISPRa工具开发与优化的设计思路，开发的高效转录激活工具dCas9-VPRF有望进一步应用在遗传疾病治疗产品中。
松阳洲教授课题组2018级博士生刘嘉琪和副研究员陈昱僖为该论文的共同第一作者，松阳洲教授和梁普平副教授为共同通讯作者，微光基因（苏州）有限公司为合作单位。
