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问题
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可能原因
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验证或解决办法
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背景高
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膜没有完全均匀湿透
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使用100% 甲醇浸透膜5-10min
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洗膜不充分
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增加洗液体积和洗涤次数
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阻断不充分
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增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，A，酪蛋白等）
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二抗浓度过高
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降低二抗浓度
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检测过程中膜干燥
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保证充分的反应液，避免出现干膜现象
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曝光过度
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缩短曝光时间
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抗体与阻断蛋白有交叉反应
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检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应
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没有阳性条带，或者阳性条带比较弱
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抗体染色不充分
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增加抗体浓度，延长孵育时间
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酶失活
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直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
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标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低
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设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。
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试剂不匹配
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一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性
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一抗失效
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选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液
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HRP抑制剂
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所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
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膜没有完全均匀湿透
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使用100%甲醇浸透膜
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靶蛋白分子量小于10Kd
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选择小孔径的膜，缩短转移时间
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甲醇浓度过高
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过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
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转移时间不够
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对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间
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抗体染色不充分
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增加抗体浓度，延长孵育时间
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标本中靶蛋白含量太低
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增加标本上样量。
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HRP抑制剂
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所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
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抗体活性降低
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选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置
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封闭过度
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减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型
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曝光时间过短
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延长曝光时间
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条带位置不对；或有非特异性条带
色带）
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二抗的非特异性结合
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增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）
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一抗的特异性不够
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使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性
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蛋白降解
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使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂
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二聚体或多聚体存在
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增加蛋白质变性过程及强度
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抗体浓度过高
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降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带
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蛋白上样量过大
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降低上样量
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封闭剂中有聚集体
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使用前过滤封闭试剂
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HRP耦联二抗中有聚集体
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过滤二抗试剂，去除聚集体
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HRP含量过高
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降低酶联二抗的浓度
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