1.概 述
mRNA差异显示技术（mRNA differetial display）是一种快速有效的克隆差异性表达基因的方法。
方法建立：1992年 Liang P和Pardee首次应用DD技术对比人类乳腺癌细胞与正常细胞所表达的mRNA，以此来克隆癌细胞所特有的基因
目前已应用于个各领域：
农业、植物
动物
医学
• 胚胎发育
• 遗传病
• 药物
• 肿瘤
2.mRNA差异显示原理
是分离差异表达基因的一个重要方法。人类大约含有三万个不同的基因。在不同的单个细胞中只有10％的基因处于表达状态。
生物体在不同的生理，病理状态下，基因的表达水平不同。
生命过程中选择性表达的基因主要有：发育与分化、体内平衡、对攻击的应答、细胞周期调节、老化和程序性细胞死亡等。
差异显示获得的只是某个基因的片段，而不是直接获得全长cDNA克隆。
3.基本程序
选择表型特性差异显著对象
展示mRNA的差异
基因差异
克隆与表型差异高度相关的新基因
4.技术
• 基本技术
逆转录（ RT ）
聚合酶链反应（PCR）
凝胶电泳
5.RT-PCR
• 锚定引物 T12-MN，含有12个T可以结合于mRNA 3`端 poly（A）尾，M为A、C、 G 3种碱基之一，N为A、T、C、G 4种碱基之一。
• 荧光锚定引物 ，引物5`端加入T7 RNA多聚酶启动子并带有荧光分子
----------- AAAAAAAAAA –3` mRNA
------------XAAAAAAAAAAA–3` 1/3 mRNA
MTTTTTTTTTTTT（12T） Prime
---------YXAAAAAAAAAAAAA –3` 1/12 mRNA
NMTTTTTTTTTTTT（12T）Anchor Prime
•荧光锚定引物：
NMTTTTTTTTTTTT- T7 RNA多聚酶启动子-荧光分子
（Genomyx company）
因此共有12种锚定引物
• 同位素标记锚定引物
•随机引物 （Arbitrary Prime）
可以随机地与cDNA不同位置多个位点结合，扩增出不同长度的cDNA片段混合物。
共20种随机引物，随机引物-M13
•随机和锚定引物的多种组合可以展示 10000-15000种mRNA
6.技术路线
mRNA 差异显示技术
The fluoroDD System
•Builds on the HIEROGLYPH™ system
–TMR-labeled anchored primers
–Increased primer concentrations
–Increased dNTP concentrations
–Optimized DD-PCR protocol
–TMR-labeled M.W. markers
Genomyx Research into Improving the Process of Differential Display
•Optimize gel electrophoresis
•Optimize PCR
•Optimize primers
•Streamline downstream analysis
HIEROGLYPH™ mRNA Profile Kit Primers
Advantages of HIEROGLYPH™ DD Primers
Genomyx LRS
genomyxSC and fluorescent labeling
Band Recovery with Virtual Grid and Excision Workstation
7. 差异显示的优越性
•仅需少量的总RNA（0.2-0.02ug，200个 细胞中提取的总RNA）
•PCR放大作用，灵敏度高
• 同时分析多组样品
•实验周期短，8天可以完成
•最突出的优点是实验过程中可步步验证
–RNA提取
–RT-PCR
–切胶后再扩增
–克隆
–测序
–Northern验证
–RT-PCR
8.存在的问题和对策
•假阳性率高（50-70%）
–提取RNA时，防止DNA的污染（DNA酶充分消化）
–切胶时选择差异显著的条带，选择或有或无的条带
– 基因克隆时阳性菌落的挑选
–PCR扩增中交叉污染
–Reverse Northern确认
•扩增片段短
– 扩增片段较短（〈500bp），信息少
–RACE（Rapid Amplication of cDNA Ends)
–基因文库得到 cDNA全长
9.医学中的应用
•骨科
–Boden 发现LMP-1基因，并用于基因治疗
•溃疡性结肠炎
–Zuo 发现溃结黏膜25个表达基因
•肿瘤学研究方面
是一个重要的手段。 如胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌等，并取得了令人鼓舞的研究进展。Samant等应用差异显示技术克隆和鉴定新的乳腺癌转移抑制基因（BRMS1），Chung等在小细胞肺癌中克隆出新的跨膜GTPase基因。在国内Chen等分离鉴定2个与食管癌相关的基因，SPRR3和Transglutaminase-3。
胃癌组织中，Yoshikawa等用差异显示技术分离和鉴定了2个新的基因，与正常组织比较发现它们在人胃癌中下调。Shiozaki等报道一个新的胃特异性基因CA11，它在胃癌细胞中下调，通过基因文库的鉴定
胃癌及癌前病变差异显示研究
