钙离子不仅是植物生长发育所必需的1 种大量元素, 而且在植物的信号传导中起重要作用。钙离子作为一种第二信使把外源信号(激素、光、重力、温度等) 转变成胞内信号, 导致一系列胞内事件的发生。大量的研究表明, Ca2+ 的信使功能是通过调控细胞内游离Ca2+ 浓度来实现的。Ca2+ 信号的产生和终止是细胞内Ca2+ 增减、波动的结果。因此测定细胞溶质中的Ca2+ 浓度是十分重要的。
从理论上讲, 测定细胞内Ca2+ 浓度的方法应符合如下要求: 首先, 所使用的Ca2+ 指示剂必须对Ca2+ 有很强的专一性; 其次, 是灵敏度高, 能够测定低浓度的 Ca2+ ; 第3, 对Ca2+ 水平改变的反应必须比细胞内Ca2+ 信号引起的相关生理反应快; 第4, 不会破坏细胞内的正常生理生化过程。
Ca2+ 测定方法有金属铬指示剂法、偶氮胂指示剂法、微电极法、荧光蛋白指示剂法以及钙荧光指示剂法等。下面主要介绍两种常用的方法: 荧光蛋白指示剂法和钙荧光指示剂法。
1 荧光蛋白指示剂
在20 世纪60 年代初, Sh imomura 等从多管水母属 (A equoria v ictoria) 中分离出1 种钙水母荧光蛋白, 该蛋白与Ca2+ 结合后, 辅基被氧化并发出蓝光。这种蛋白对生物体内Ca2+ 的微量变化很灵敏, 在0. 1～ 10 LmolöL 范围内, 荧光强度与Ca2+ 浓度成正比。
这种蛋白的优点是: ①发光不需要外加任何底物或辅助因子, 仅以蓝色或紫外光照射就能激发其荧光; ② 检测方便, 钙水母荧光蛋白发射的荧光很强, 且很稳定, 用肉眼或荧光显微镜就可以检测到; ③无毒性, 不会影响细胞的正常生长发育; ④它是一种高负电性蛋白, 没有区域化现象, 也不会渗出细胞。缺点是: 分子量大, 必须采用微注射法进入细胞, 只能用于大型细胞, 而且发光高峰发生迟缓, 比相应生理过程要慢。
目前采用基因工程的方法, 改变钙水母荧光蛋白的光谱性质和灵敏度, 并将克隆的钙水母荧光蛋白基因导入烟草等植物细胞, 并在其中表达, 不仅成功解决了人工注射的困难和对细胞的伤害问题, 还可进行植物整株各部分细胞Ca2+ 测定, 而且也可以更加准确的定性、定量测定细胞内Ca2+ 浓度。
2 钙荧光指示剂
2. 1 钙荧光指示剂概述
钙荧光指示剂法是目前应用最广泛的, 也是较好的测定胞内Ca2+ 浓度的方法。这种荧光指示剂对Ca2+ 有高度选择性和高亲和力, 能够检测低浓度的Ca2+ , 并且应答迅速。根据激发或发射光谱的特征, 可将它们分成单波长荧光指示剂和双波长荧光指示剂。
1982 年, 加利福尼亚大学的T sien 等合成出了第1 代Ca2+ 荧光指示剂, 包括Q uin21、Q uin22、Q uin23。其中 Q uin22 的准确度较高, 对钙的亲和力较高, 适于静态细胞钙的测定, 但具有对温度敏感、激发波长较短、光稳定性差及离子选择性差等缺点, 并且所需的Q uin22 浓度较高, 要达到0. 5mmol/L 才能高出背景荧光。
