摘要：细胞内游离钙离子与信号转导以及细胞的各种生理病理现象密切相关，因此检测细胞内游离钙离子具有非常重要的意义。其测定方法随着近年来仪器与技术的进步而有了长足的发展，包括电极法、同位素示踪法、核磁共振法、高流通量测定法、离子指示剂法等，本文主要介绍这些方法的特点和应用情况。
关键词：细胞内钙离子；测定方法；综述
Development of Assay Method for Intracellular Free Calcium
Abstract：The calcium ion is one of the most important universal signaling molecules, regulating almost all known cellular functions and processes. The change of intracellular free calcium concentration is closely correlated with signal transduction and kinds of cellular pathophysiological phenomena. Therefore, the measurement of intracellular free calcium is very meaningful. In this article, we review the methods and techniques for intracellular free calcium determination, including electrode method, isotope tracer method, NMR method, high-throughout method, ion indicator method and so on. The feature and applications of each method are also discussed.
Key words：intracellular calcium ion; assay method;review
钙离子（Ca2+）是已知最通用的细胞内信使之一，几乎可以调控所有细胞功能。细胞内Ca2+ 浓度的改变，通过不同的信号通路、细胞器以及跨细胞 Ca2+ 依赖过程的幅度和周期来调节细胞过程[1]。实际上，Ca2+ 几乎在所有生物的细胞过程中都起着主要的协调作用[2]。只有游离钙才能在细胞内发挥其生物活性，要准确分析钙在生命活动中的作用，就必须准确地测量细胞内钙浓度的瞬时动态变化[3]。近年来，细胞内Ca2+ 的测定技术在国内外发展迅速，本文就这一方面加以总结。
1 电极法 Ca2+选择性电极是通过电势来测定Ca2+的浓度，将离子络合剂掺入液态的亲脂膜，使膜自身可选择性的从水溶液中提取离子，并加以转移，产生与浓度差成比例的膜电势。在没有其它离子干扰的情况下，未知离子浓度（C ）和参比浓度（C r ）间的电势差（ V）符合V= 28 log (C/Cr) 的Nernst方程。Ca 2+ 选择性电极的动态范围比荧光指示剂宽，但对游离Ca2+ 改变的反应时间（约0.5～1 s）比荧光指示剂慢 [4]。该方法能直接测定细胞内Ca2+ 浓度，连续提供活细胞内Ca2+ 的动态变化信息，但是电极穿刺不适合太小的细胞。离子选择性微电极作为一种快速、方便和相对便宜的方法，目前多用于植物组织及细胞内Ca2+ 测定[5]。
2 同位素示踪法 对Ca2+ 利用放射性核素45Ca2+ 进行示踪，可测量出通过细胞膜转运到细胞内Ca2+增加的速度及浓度大小，揭示钙离子通道和钙离子泵的作用，目前主要用于测定跨膜Ca2+流动[6]，静息状态的测定效果不理想。放射性同位素作为示踪剂可以检测1.0×l0-18～ 1.0×10-19的放射性核素，比普通化学分析法的灵敏度10-12 g 要高得多，确定放射性示踪剂在组织器官中的定量分布，可以达到细胞、亚细胞乃至分子水平，并且测量方法简便易行，更符合研究对象的生理条件[7]。其缺点是需要特定的同位素测定仪，并注意示踪剂的同位素效应和放射效应问题。
3 核磁共振法 19FNMR 是一种细胞内Ca2+ 测定的非光学方法，由于正常生物体内含氟成分很少，为了得到足够的响应，在检测游离Ca2+ 浓度时需要使用含氟指示剂，目前常用的是nF-BAPTA[n fluoro-1,2-bis(2-aminophenoxy) ethane-N,N,N＇,N＇tetraacetic acid]衍生物。 nF-BAPTA不能以游离酸形式直接进入细胞内部,需要经过化学修饰以乙酰氧甲酯（acetoxymethyl-ester, A M ）的形式（n F - B A P T A - A M ）进入，之后在细胞内水解，重新成为游离酸形式，与细胞内游离Ca2+ 结合形成螯合物Ca2+-nF-BAPTA。这种结合具有快交换和慢交换两种性质，取决于Ca2+ 相对于nF-BAPTA 的解离程度Kd。用核磁共振检测具有快交换性质的 5F-BAPTA 在NMR 波谱图上得到2 个峰：结合Ca2+ 的 Ca2+-5F-BAPTA 峰和未结合Ca2+ 的5F-BAPTA 峰，由 2 峰的峰面积比和解离常数，可计算细胞内游离Ca2+ 浓度；对于具有慢交换性质的4F-BAPTA 会出现单峰，利用结合与未结合Ca2+ 的4F-BAPTA 的化学位移计算Ca2+ 浓度[8]。
此法具有非破坏性和无损伤性，能在近生物样本生理状态下连续动态地检测细胞内游离Ca2+ ，显示完整的有机组织细胞内Ca2+ 的变化。主要缺点是实验室必须备有核磁共振仪，测定成本高。
4 高流通量测定法 高流通量技术已经给药物发现过程和生物医学研究带来了变革，现在正用于许多药理学和细胞信号的研究，使细胞内Ca2+ 的测定对于基础研究来说更具吸引力。高流通量模型测定细胞内钙信号以全自动定量绘图酶标仪为基础，要求其适应不同Ca2+ 亲和力和光谱性质的荧光探针；有足够的时间分辨率来记录广阔的时程；在数据获取期间可以适应细胞环境。第一个Ca2+ 高流通量筛选的仪器被称为荧光
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