本文主要介绍表达蛋白的柱层析及电泳分离,以及建立于SDS-PAGE基础上的Western杂交.Western杂交采用特异的抗血清结合反应以鉴别经SDS－PAGE分开的特异蛋白质。电泳分离的蛋白质经电转到NC膜上，一抗特异的与其抗原决定族结合，所结合的抗体可由二抗来检测。
实验1 SDS－PAGE
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。调节单体的浓度比，形成 不同程度交链结构，其胶连度可在一个较广的范围内变化，适应不同大小分子的物质分离。在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和加速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂 和加速剂的配伍如下表：
引 发 剂 加 速 剂
（NH4)2S2O8 TEMED
(NH4)2S2O8 DMAPN
核 黄 素 TEMED
上述为化学催化，除此为尚有发光催化，即利用核黄素与硫酸亚铁体系，在强光照下，诱发胶连。凝胶浓度不同，分离的分子范围也不同，下表为相关数据
物 质 分子量范围 适用的凝胶浓度（%）
蛋白质 &10 20-30
1-4×104 15-20
4×10-1×105 10-15
1-5×105 5-10
<5×105 2-5
核酸 &104 10-20
104-105 5-10
105-2×106 2-3.6
但胶浓度过大过小，均不利于操作，浓度20％以上，胶柔性低，易裂；胶浓度过低，如低于7％，则机械强度不过，此时可通过添加琼脂糖或采用薄胶（如测序胶、IEF等）等方法加以克服。
PAGE类型很多，从电泳槽种类分有垂直、水平及圆盘电泳等；从胶浓度来分有连续胶、不连续胶、梯度胶等；从胶组成成分来分有SDS－PAGE、IEF等。本部分实验即通过SDS－PAGE、IEF的操作，以求学员对电泳技术有一较为系统的概念。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率仅取决于分子量大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种电荷屏闭作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS可使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成长椭圆棒形，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。但当蛋白质中存在二硫键时，因局部高级结构存在，将影响蛋白质与SDS的结合及结合后的结构，因此测定分子量不真实，为表观分子量。鉴于此在进行蛋白质分子量测定时，一定要在样品缓冲液中加入巯基乙醇，除非实验目的是要通过对角线电泳研究蛋白质中的二硫键问题时，不加巯基乙醇。蛋白质的SDS-PAGE技术可以用来进行蛋白质的分离纯化、蛋白质纯度测定及分子量测定等方面的工作。
一：仪器:摇床,离心机,超声波粉碎机
二：试剂 4×样品缓冲液(0.5M Tris, pH6.8、2%SDS、20%甘油、0.04%溴酚蓝2%β-巯基乙醇)
30%的凝胶母液 (丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:1) 10％过硫酸铵 TEMED
分离胶缓冲液 1.5M,pH8.8、Tris-Hcl
浓缩胶缓冲液、1M,pH6.8,Tris-Hcl、10%DSDS
10×电极缓冲液(30g Tris、141g甘氨酸、10gSDS、pH8.3 定溶至1000ml) 蛋白分子量标准
三：操作:
1:用样品缓冲液提取蛋白
2制胶 a:装模具
b:制下层胶
胶浓度10% 12ml胶母液、16.6ml分离胶缓冲液、无离子水10.4 ml抽气后加入10%SDS0.4ml、加入10％过硫酸胺400μl、20μlTEMED, 总体积40ml混合,倒入模具（高度约为模具的１/３）,上覆一层水或浓缩胶缓冲液.
C:胶聚合后,弃胶上层未聚合液。配制浓缩胶，2.5ml胶母液，1４ml水，2.５ml浓缩胶缓冲液，0.3 mlSDS,500μl过硫酸胺,2５μl TEMED,混合,倒于分离胶上面，并插入梳子。
(2)电泳
a：将凝胶与电泳系统相连，用电极缓冲液清洗样品孔
b：点样,走电泳，直至溴酚蓝走至胶下沿。
(3)停止电泳，卸板、切胶,一半胶(含柱样品)染色,脱色,制干胶,以研究纯度,分子量及菌体蛋白组成。
另一半用于电转移及杂交实验。
实验-2 IEF分离蛋白质
等电点聚焦电泳（IEF）就是在电泳胶中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质在此体系中泳动时，不同的蛋白质即聚焦于与其等电点相当的pH位置上，电聚焦的优点是：有很高的分辨率，可将等电点相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开，由于IEF可使用超薄胶，并且其工作原理是建立在蛋白质等电点的差异上，因此分辨率极高，其与SDS－PAGE进行双向电泳的结果最多可以给出105以上的信息，是目前蛋白质组学研究的主要手段；一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走的距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄；由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其电点，很稀的样品也可进行分离；可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01pH单位。电聚焦技术的缺点是：一是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，二 是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。本部分实验即要求学员掌握最基本的IEF原理及具体操作，以适应后基因组时代的研究要求。
一仪器：高压电泳仪、IEF槽、离心机等
二试剂：样品提取液（8M尿素、2％非离子型去污剂NP－40、
2％Ampholin,pH3.5-10、2％DTT）
胶母液 （30％的29/1的Acr/Bis），两性电解质
阳极缓冲液 1M磷酸
阴极缓冲液 1M氢氧化钠
固定液（10％的三氯乙酸、1％的磺基水杨酸）
染色液（35％乙醇、10％冰醋酸、0.15%考马氏亮蓝R250）
脱色液（35％乙醇、10％冰醋酸）
三操作：
1：样品提取
1)1ml原核表达细胞液离心取沉淀
2)沉淀用100ulIEF样品缓冲液裂解，离心取上清
2：制胶
1)：安装超薄胶装置
2)：依次加入下述试剂
胶母液 2ml
尿素 8M /脱气
NP－40 0.2ml
两性电解质 2ml
10%过硫酸胺 50ul
TEMED 5ul
3)：倒胶
3：电泳
1)：预电泳 胶凝固后，拆卸制胶装置，将胶连同支持膜一起置于水平电泳槽上（要求，电泳槽面板上首先被液体石蜡浸润，在凝胶支持膜与电泳槽面板间无气泡），
2)：将分别被阴阳极缓冲液浸润的电极条置于胶面上将与阴阳电极接触的部位 ，盖上电泳槽罩子，连通电源，200V预电泳10min。
3)：电泳，将薄棉纸剪成小块，轻轻置于预备点样的胶面上，取10－15ul样品液，点于薄棉纸上，盖上罩子，连通电源进行电泳
4)：电泳参数
200V 30min,400V 30min,800V4hr
4：染色
1)：固定，将电泳完的胶连同支持膜放置于固定液中，10min.
2)：显色，50℃下，将胶与支持膜放置于染色液中，显色，直至条带出现。
实验-3 蛋白质的柱层析分离
色谱法是1906年俄国植物学家Michael Tswett将植物叶子色素和溶液通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子，加以分离时而发现并命名的。因实验中各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开并形成不同的色带，因此将该技术名为色谱法（Chromatography），又称层析法。层析技术种类繁多，按两相所处的状态可分为： 液－固色谱（liquid-solid chromatography）、液－液色谱（liquid-liquid chromatography）、气－固色谱 （gas-solid chromatography）、气－液色谱（gas-liquid chromatography） ；按层析过程的机理可分为：吸附层析（adsorption chromatography ）即利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的；分配层析（partition chromatography）即利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数（或溶解度）不同，而使之分离的方法；离子交换层析（ion-exchange chromatography ）即利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，而进行分离的方法；凝胶层析（gelchromatography）利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异，进行分离的技术。按操作形式不同可分为：柱层析（colum chromatography）将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离；纸层析（paper chrmatography）用滤纸作液体的载体（担体support），点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的；薄层层析（thin layper chromatography）将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
本实验即拟通过利用凝胶层析技术分离原核表达蛋白的操作，使学员了解和掌握层析技术的基本原理及操作。
一：凝胶层析的基本原理
一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现出分子筛效应。
二：重要参数
1：参数⑴柱床体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。常用Vt 表示。⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。但不包括固体支持物的体积（Vm）。⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ve 表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。⑸Kd:每个溶质分子在固定相和流动相之间的分配系数。
参数间的相互关系
2：参数间关系
⑴Vt=Vo+Vi+Vm;⑵Ve=Vo+Kd×Vi;⑶Kd=(Ve-Vo)/Vi
3:参数Kd分析
当Kd＝0时，表明溶质颗粒被完全排阻，不能进入凝胶颗粒；当Kd＝1时，表明溶质颗粒完全进入凝胶颗粒，上述两种情况都不能进行分离。因此对于分离特定分子来讲，要求其0
对于特定凝胶和特定分离条件来讲，一种分子的Kd不变，因此利用分子筛层析可测定待分离成分的分子量。
三：主要凝胶的种类及性质
1交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴Sephadex G，交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。G越大，孔径越大。⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
2琼脂糖凝胶：常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
3聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
4聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ， 具有大网孔结构， 可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
四：仪器 蠕动泵、层析柱、紫外检测仪、记录仪
五：试剂 Sephadex G75
样品提取液（0.1Mtris-HCl,pH8.0、0.1MNaCl、1%SDS、1%PVP）
蛋白洗脱液（0.05M tris-HCl,pH8.0、0.1MnaCl、1%PVP）
六：操作
1取3×1.5ml蛋白原核表达培养液，离心取沉淀
2样品提取液1.5ml悬浮沉淀，裂解细胞，溶解蛋白
3充分浸泡过的凝胶装柱，连接各种仪器，洗脱液平衡
4上样
5洗脱液洗脱至蛋白峰结束。
实验4 蛋白质的电转
很多膜可作为蛋白质电转移的固相支持物，如重氮化纤维素膜（DPT, DBM)、DEAE-纤维素膜、尼龙膜等，但用的最多的还是硝酸纤维素膜(NC膜)，该膜与蛋白质以非共价的疏水作用形式结合，结合能力约为８０μg/cm2。与其它膜相比，NC膜具有不要预先活化，对转移物质生物活性影响不大，能应用多种染料染色，非特异性显色浅的特点，但对于转移的小分子蛋白质在洗涤过程中，易于丢失。
一:仪器: 电转移槽及电泳仪
二：试剂 转移缓冲液
含20%甲醇的电极缓冲液
三:操作
1：剪６块３MM滤纸和一块NC膜
2:将剪好的３MM滤纸和NC膜在转移缓冲液中浸泡3-5分钟
3:按下列过程安装转移装置,将塑料支架平放在含转移缓冲液的托盘中,在塑料支架上放一块海绵.
4:将3块３MM滤纸对齐放在海绵上,然后依次将NC膜、凝胶、及另３块虑纸和海绵放上。
5:用塑料支架夹紧上述各层，放入电转移槽内，NC膜一侧向正极，凝胶一面向负极。
6:接通电源电压120mA，转移6小时以上或过夜。
7:转移结束后，取出塑料支架,依次取掉各层,用铅笔在膜的上沿作好标记，切下其中一个孔所对应膜的一半,用氨基黑或考马士亮兰染色,检查转移效果。
8:将其余的NC膜放在一张干净的３MM滤纸上，室温干燥30-60分钟（可不做）。
注意1，虑纸及膜的大小不应大于待转移胶的大小，否则在转移过程中会发生短路，影响转移效果。2，操作中应戴手套，切不可用手直接触摸，因手上的汗和分泌物将直接影响到蛋白从胶向膜的转移。3，放置NC膜和滤纸时，每层之间不应有气泡，否则将影响转移效果4，待转移蛋白分子量决定转移时间，分子量大，转移时间长，反之则小。5，干燥虽然可使蛋白质更牢固地结合到膜上，但也可能加剧蛋白的质变性，影响其免疫反应活性。
实验－5 Bloting
Western印迹法检测蛋白的敏感性约为1-5ng，0.75mm厚的SDS-PAGE板的一个孔可上总蛋白量约为100μg，所以只要被检蛋白不低于总蛋白量的万分之一，即可被检测出来。如果所分析的样品为未知时，应同时作阳性对照。杂交技术主要有NC膜的封闭， 靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗与二抗的反应，显色等几部分构成。
该技术的原理及过程主要为转移到NC等膜上的蛋白带。用其它蛋白作为封闭液，将膜上余下的其它蛋白可结合点封闭。加入与待检测目标靶蛋白有特异性的第一抗体，经免疫反应，一抗将与目标蛋白结合，再经用洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合有第一抗体。再加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗就仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，所以通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白－一抗－二抗的位置即将呈现一定的颜色。
一：仪器: 塑料封口机 摇床
二：试剂：封闭液（TBST＋3％BSA）
漂洗液 TBST（10mMTris-HCL,pH8.0,0.15mMNaCL, 0.05%Tween-20）
PBS (0.8%NaCL,0.02%KCL,0.144%Na2HPO4,0.024%KH2PO4 pH至7.4)
辣根过氧化物酶显色液(可用Ⅰ或II)
Ⅰ 取6mg diaminobenzidine tetrahydrochloride 溶于9ml 100mM Tris-HCl(pH7.6)中，加入1ml 0.3%(w/v)的NiCl2或CoCl2。过虑去除沉淀。取10μl 30%双氧水与上液充分混匀
注意，此液必须新鲜配制。
II 取20mg,4-chlor-1-raphthol于20ml冷甲醇中，另取60μl30%双氧水，混匀。
注意，此液必须新鲜配制。
碱性磷酸酶显色液
5％NBT溶液 （溶于70％二甲基甲酰胺中） 66ul
5％BCIP溶液（溶于100％二甲基甲酰胺中） 33ul
碱性磷酸酶缓冲液 100mMNaCL 5mMMgCL2 100mMTris-HCL(pH 9,5)
以上三者充分混匀，需要在30分钟内使用完
三：操作1：NC膜漂洗，NC膜用TBST缓冲液漂洗一次
2：NC膜的封闭
NC膜与蛋白质的结合无任何特异性，因此作为特异性检测靶蛋白的探针－一抗蛋白也能与NC膜结合，而一旦这种结合情况发生，当加入二抗后，背景上将出现许多非特异性条带,而则势必造成目标蛋白的不可检测性。因此Western印迹技术的敏感性、可行性将取决于能否对NC膜上一些蛋白质潜在结合位点进行有效封闭。在实际操作中这些结合位点一般用脱脂奶粉封闭，也可用血清白蛋白封闭。如果操作中加蛋白封闭后，非特异性背景仍很大的话，则可在封闭液中加入Tween20，Tween20的存在，能降低背景噪声，且不影响抗体与靶抗原的结合。
将Ａ中经电转移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封闭液（液面需盖过胶面）室温下轻轻遥荡2-3小时。
2：目标靶蛋白与第一抗体的反应
a:一抗的稀释：将第一抗体用封闭液稀释，稀释度由预实验确定，但可参考下列数据：多克隆抗体，1:100-1:5000 培养的杂交瘤细胞上清液，1:100 鼠腹水细胞1:1000-1:10000
3:将Ｂ中封闭好的NC膜，放入塑料袋中，加入一抗，加入量为0.1ml一抗/cm2
NC膜，赶尽塑料袋内所有气泡，封口机封口，４℃下轻轻震荡２小时。
注意，在室温下，延长反应时间，可增加靶蛋白的可检出量，但也会增加非特异性结合，加大背景噪声。
4:洗膜。反应完毕后，将塑料袋剪开，弃去反应液，用PBS洗三次，每次10分钟。
5：靶蛋白－一抗复合物与二抗反应
a:将膜从PBS溶液中转至TBST溶液中，室温下轻轻震荡１０分钟。
此操作是为了去除NC膜上的磷酸及叠氮钠
b:将二抗用二抗稀释液稀释，稀释度一般为1:200-1:2000。
c:将膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般为0,1ml二抗溶液/cm2膜，封好塑料袋，在室温下轻轻震荡１小时。
6:剪开塑料袋，取出NC膜，在TBST溶液中冲洗1-5次，每次１０分钟。
7：显色
A：AP系统
a:将膜放入碱性磷酸酶显色液（10ml碱性磷酸酶缓冲液＋66ulNBT＋33ulBCIP）中，室温下轻轻摇动。
b:待条带出现后（约显色20分钟），将膜放入200ul0.5MEDTA(pH8.0)和50mlPBS溶液中
c:照相
B：辣根过氧化物酶系统
a:将膜放入显色液中，室温下轻轻摇动。
b:待条带出现后（约显色1－3分钟），立刻用水洗膜，然后转入PBS中
注意，此显色带在阳光下几小时即褪色
c:照相
