Western-Blot操作流程

2010-03-25 11:33 · winter

试剂配制 (一)母液 1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后,用浓盐酸调pH至所需点(见下所示),最后用蒸馏水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。 PH HCl 7.4 约17ml 7.5 约1

试剂配制

(一)母液

1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g

蒸馏水 200ml

溶解后,用浓盐酸调pH至所需点(见下所示),最后用蒸馏水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。 PH HCl

7.4 约17ml

7.5 约16m

7.6 约15ml

8.0 约10ml

1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g

异丙醇 100ml

溶解后,分装于1.5ml离心管中,-20℃保存。

0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4(MW119.98) 12g

蒸馏水至 500ml

溶解后,高压灭菌,室温保存。

0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO·12H2O(MW 358.14) 71.6g

蒸馏水至 1000ml

溶解后,高压灭菌,室温保存。

10%SDS SDS 10g

蒸馏水至 100ml

50℃水浴下溶解,室温保存。如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后,仍可使用。

10%过硫酸胺(AP) 过硫酸胺 0.1g

超纯水 1.0ml

溶解后,4℃保存,保存时间为1周。

(可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中,一次性多装几管,使用时加入超纯水即可)

1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8) Tris (MW121.14) 45.43g

超纯水 200ml

溶解后,用浓盐酸调pH至8.8,最后用超纯水定容至250ml,室温下保存。

0.5mol/L Tris·HCl(pH6.8) Tris (MW121.14) 15.14g

超纯水 200ml

溶解后,用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250ml,室温下保存。

40%Acr/Bic(37.5:1) 丙稀酰胺(Acr) 37.5g

甲叉双丙稀酰胺(Bic) 1g

超纯水至 100ml

溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

20%Tween20 Tween20 20ml

蒸馏水至 100ml

混匀后4℃保存。

(二)使用液

单去污剂裂解液(PMSF): 1mol/L Tris·HCl(pH8.0) 2.5ml

NaCl 0.438g

TritonX-100 0.5ml

蒸馏水至 50ml

混匀后4℃保存。使用时,加入PMSF至终浓度为100μg/ml(0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl)。

(一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方:50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。至于其中每个要加多少量那就自己去算吧,因为本人已经算好的配方表无意间弄丢了)

0.01mol/L PBS( pH 7.2-7.4) 0.2 mol/L NaH2PO 19ml

0.2 mol/L NaHPO4 81ml

NaCl 17g

蒸馏水至 2000ml

(如果用TBST进行洗膜的话,其实PBS用得很少,大可不必自己配制,向试剂公司购买20×的PBS浓缩液即可,500ml的浓缩液不到50元,很方便)

G250考马斯亮蓝溶液(蛋白定量专用) 考马斯亮蓝G250 100mg

95%乙醇 50ml

磷酸 100ml

蒸馏水至 1000ml

配制时,先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料,再加入磷酸和水,混匀后,用滤纸过滤,4℃保存。

0.15 mol/L NaCl NaCl(MW58.44) 0.877g

蒸馏水至 100 ml

高温灭菌后,室温保存。

100mg/ml 牛血清白蛋白(BSA) BSA 0.1g

0.15 mol/L NaCl 1ml

溶解后-20℃ 保存。制作蛋白标准曲线时,用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml,-20℃保存。

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