摘要：利用流式细胞仪比较PI 法和Annexin V/PI 法检测不同时间人肝癌细胞感染蓝舌病毒HbC3 的凋亡率分析。结果：PI 法在 24h、36h、48h 的凋亡率分别为10.8 ±3.05、21.7±6.28、28.3±10.6；Annexin V/PI 法的凋亡率分别为20.42±3.70、49.3±8.11、79.6±11.5。二种方法及不同时间感染病毒细胞的凋亡率之间有显著差异（P&0.01）。证明了Annexin V/PI 法能特异地、准确地检出早期凋亡的细胞、继发性坏死的细胞，BTV-HbC3 诱导 Hep-3B 细胞凋亡是致肿瘤细胞病变、死亡的重要表现形式之一。
关键词：Propidium iodide (PI)；Annexin V/PI；凋亡；流式细胞仪
细胞凋亡在个体系统发育、分化，特别是个体在多种外界刺激时所形成的特定生物学效应方面具有重要的意义。引起人们重视凋亡与肿瘤的研究的原因主要有两个。第一，诱导癌细胞的凋亡才能使癌缩小或消失；第二凋亡是机体防止、清除体内受损伤而不予以修复的细胞、癌前病变、基因发生改变的细胞[1,2]。对肿瘤治疗，大多数化疗和放疗手段均通过诱导肿瘤细胞凋亡机制进行。目前，很多病毒能诱导肿瘤细胞的凋亡而达到治疗肿瘤的目的[3]。蓝舌病毒是dsRNA 病毒，属于呼肠孤病毒科环状病毒属的代表种，主要危害绵羊及野生反刍动物，导致这类被感染动物高死亡率的致病性病毒[6]。本文拟探讨不感染人正常细胞，不引起人任何疾病的动物蓝舌病毒HbC3 （Bluetongue Virus HbC3 strain, BTV- HbC3）是否诱导人肿瘤细胞凋亡的能力；比较两种不同染色方法经流式细胞仪检测蓝舌病毒HbC3 株诱导人肝癌细胞Hep-3B 的凋亡情况。
1 材料和方法
1.1 病毒与细胞
蓝舌病毒HbC3 株、人肝癌细胞Hep-3B 由武汉大学医学院病毒所肿瘤病毒研究室所提供,Vero 细胞由本室常规保存。
1.2 试剂与仪器
PI (sigma)染液的配制：将PI 溶于PBS (pH7.4)中，终浓度为100μg/mL, 含RNase 100μg/mL、0.1%Triton X-100；Annexin V/PI 试剂盒（BenderMedsystem, USA）；EPICS ALTRAⅡ流式细胞仪（Beckman, USA）。
1.3 BTV- HbC3 接种Hep-3B 细胞实验
Hep-3B 细胞采用含10％小牛血清的DMEM培养基，置于37℃，5％CO2 条件下培养，常规法培养传代Hep-3B 细胞分别于25mL 八个培养瓶里。设不接种病毒对照组与接种病毒感染组。以0.1mL 病毒悬液（104TCTD50）分别接种BTV- HbC3 于6 瓶Hep-3B 细胞； BTV-HbC3 吸附细胞1h 后，弃病毒液，用PBS 洗细胞三次，然后加入含2％小牛血清的DMEM 培养基维持培养, 第3 天收集所有细胞。
1.4 流式PI 染色法
收集培养液和消化下来的细胞离心，调整细胞浓度为1×106，加入75％冰乙醇固定，放于4℃冰箱过夜，离心、洗细胞出去乙醇后，加入事先配好 1mL PI 染液，4℃避光30 min，上流式细胞仪检测。
1.5 流式Annexin V/PI 法
以1: 4 稀释binding buffer （50mL buffer +150mL 蒸馏水），在稀释的buffer 重悬细胞，并调整细胞浓度2-×105/mL，取195μL 细胞悬液加入5μL Annexin V-FITC, 室温孵育10 min, 洗细胞n 次后，再重悬细胞于190 μL binding buffer, 加入10 μL PI, 室温孵育10 min, 上流式细胞仪检测。
