【原理】
限制性显示PCR技术(RestrictionDisplayPCR,RD-PCR)技术的思路是在获得反转录的cDNA之后,进行Sau3AI酶切?Sau3AI识别位点是四个碱基,理论上计算平均每256个碱基有一个识别位点,然后在酶切片段的两端加上通用接头?接头由15bp和21bp长的两条互补寡核苷酸单链逐步退火形成,接头的一端为4个碱基的粘性端GATC,恰好与选用的Sau3AI的酶切位点互补,另一端为2个碱基的粘性端CA,可以减少片段自身间的串联?酶切片段加上接头之后,用与接头序列配套的限制性引物进行扩增?此时设计的限制性引物是在通用引物的GATC端分别加上一个碱基A?T?C?G(以下简称A?T?C?G),可以使扩增产物有序归类?将引物A?T?C?G两两组合,共10组,以接头与cDNA酶切片段的连接物为模板,进行限制性分组PCR反应,各组产物在8%的变性聚丙烯酰胺凝胶中平行电泳?经EB染色后,在紫外灯下观察,诱导前后的基因差异一目了然?
【试剂与器材】
1.OligdT150.1μmol/L
2.TRIzol试剂
3.M-MLV
4.内切酶Sau3AI?
5.dNTP2.5mmol/L分别取等体积的10mol/L的dATP,dGTP,dTTP,dCTP四种混合即成
6.TaqDNA聚合酶(国产或进口):浓度为5U/μl,50μl反应液中加1U?
7.消毒三蒸水
8.6×载样buffer0.25%二甲苯青FF,0.25%溴酚蓝,30%甘油
9.50×TAE电泳Buffer12.2gTris,2.85ml冰醋酸,10ml0.25mol/LEDTA(pH8.0),加水至50ml?
10.溴化乙锭(EB)溶液10mg/ml(避光保存),每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液,即凝胶中EB终浓度为0.5μg/ml,此试剂为强致癌物,要戴手套操作,避免污染环境?
11.DNAMarker
12.各种国产或进口移液器(10,20,100μl)
13.消毒的0.2mlPCR管,10μl,100μltips
14.离心机
15.PCR仪
16.水平电泳槽和电泳仪
17.紫外分析仪
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【操作步骤】
1.诱导后细胞的总RNA的抽提
将细胞以4.0×108/L密度接种于用12孔培养板中,每孔3mL,37℃?5%CO2孵箱中培养至细胞贴壁,加入长春新碱,使之终浓度分别为0?10?100μg/mL?继续培养过夜?按Trizol试剂盒说明,在预期时间加入1mLTrizol试剂,置室温5min,吸至1.5mL经DEPC水处理过的EP管中,置室温5min,加氯仿0.2mL,振摇50s,置室温5min,分层?4℃,11000×g离心15min?仔细取上层水相,移至另一EP管中,加0.5mL异丙醇,混匀?置室温10min,4℃11000×g离心10min,用DEPC处理的75%乙醇洗涤沉淀(RNA),4℃,7200×g离心5min,弃上清真空干燥后,沉淀溶解于20μL无RNase的水中,样品保存于-20℃备用?RNA样品用紫外分光光度仪测定A260和A280,计算含量?
2.从总RNA中纯化mRNA,参照mRNA纯化试剂盒说明,步骤如下
• 在0.4ml的总RNA溶液中加入50μl4.5MNaCl,55~60℃水浴10分钟?
• 将以上溶液转移至装有50mgOligodT的1.5ml的离心管中,振摇混匀,室温放置30分钟,每隔5分钟振摇一次?将上述混合粘液转移至另一套在1.5ml的EP管的离心柱,并用0.1ml的SolutionC润洗,室温,10000×g离心4分钟?弃洗脱液?
• 在离心柱中加入0.5ml的SolutionC,轻轻吹打,混匀,室温,10000×g离心4分钟?弃滤液?
• 将离心柱放在另一干净的1.5ml的EP管中,加入0.5mlSolutionD,轻轻混匀,室温,10000×g离心4分钟?将洗脱液转移至另一1.5ml的EP管中,再加入0.5mlSolutionD,轻轻吹打,混匀,室温,10000×g离心4分钟?
• 将两次洗脱液混合,测量总体积,加入1/10体积的SolutionB混匀,再加入两倍体积的无水乙醇,-20℃放置至少10分钟?
• 4℃,10000×g离心10分钟,弃上清,空气干燥5分钟?
• 加10μlSolutionD溶解沉淀,取0.5μl进行定量,其余-70℃保存?
3.从mRNA反转录成为cDNA,参照TaKaRa公司cDNA试剂盒说明,步骤如下:
(1)cDNA第一链的合成
在微型离心管中混合以下反应液,总体积为50ul?
所加物品
体积
模板mRNA
5μg
5×1ststrandsynthesisbuffer
10μl
dNTPMixture
5μl
RNaseInhibitor
5μl
Oligo(dT)18Primer
5μl
RAV-2ReverseTranscriptase
100units
DEPC-H2O
upto50μl
轻柔混匀?室温放置10分钟,然后转移至42℃反应1小时?置于冰中冷却2分钟?
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(2)双链cDNA的合成及末端平滑化
在50μlcDNA第一条链的合成反应液中,加入下列组分,使总体积为202.5μl
5×2ndStrandSynthesisBuffer50μl
DEPC-H2Oupto202.5μl
加入32.5ulE.ColiDNAPolymeraseI,5μlE.ColiDNAfreeRNaseH/E.ColiDNALigaseMixture,轻柔混匀?依次反应:12℃,1小时;22℃,1小时;70℃,10分钟?加入10μlT4DNAPolymerase,轻柔混匀?37℃反应10分钟?加入25μlEDTA(pH8.0)和25μl10%的SDS,轻柔混匀,停止反应?
(3)双链cDNA的纯化
将300μl酚/氯仿溶液加入到300μl的双链cDNA合成反应液中,振荡,混匀?10000rpm离心1分钟,液相分离,将上层水相转移至另一微量离心管中?重复以上步骤?向水相加入600μl乙醚,混合均匀,离心几秒钟,完全移去乙醚层?加入300μl4M的醋酸铵?600μl异丙醇,混匀,-20℃放置30分钟?轻轻摇动至室温,10000rpm离心10分钟,弃上清?用80%乙醇清洗沉淀几次,10000rpm离心10分钟,然后真空干燥?用50μlTEbuffer将沉淀溶解,取0.5μl进行定量,其余的-70℃保存?
4.cDNA的酶切
cDNA溶于20μl水中,定量后,取大约2μg进行酶切反应?
2.4μl10×buffer
1.6μlSau3AI
37℃进行酶切反应,时间2小时?
5.通用接头的制作
采用PCR引物设计软件Oligo5.0设计两条单链寡核苷酸片段来生成接头,SIP:5'pGATCmCACACCAGCCAAACCCA3',SIR:5'GGTTTGGCTGGTGTG3',上海生工合成?接头生成按如下进行:
SIP(500ug/mlinwater)20μl
SIR(380ug/mlinwater)20μl
混合后,90℃3.6分钟,80℃3.6分钟,70℃3.6分钟,60℃3.6分钟,50℃3.6分钟,40℃3.6分钟,30℃3.6分钟,20℃3.6分钟,4℃保持?分装后,贮藏于-20℃备用?
制备好的接头为双链的寡核苷酸分子,结构如下示意图:一边是含有5'pGATC的粘性端,可以和用Sau3AI酶切后同样含有GATC粘性端的cDNA片段分子相连接,另一端含有CA粘性末端,可以减少酶切片段之间的自身连接?
5'pGATCmCACACCAGCCAAACCCA
GTGTGGTCGGTTTGG
6.接头与cDNA酶切片段的连接
参照TaKaRaDNA连接试剂盒说明及所提供的试剂,步骤如下:
所加物品
需加体积
cDNA酶切反应液
5μl
接头
5μl
Solution2
10μl
Solution1
20μl
混合均匀后,于16℃连接1小时?
>
7.RD-PCR反应
(1)用引物设计软件Oligo5.0设计与SIR/SIP接头配套的通用引物U,其序列为GGTTTGGCTGGTGTG?
设计的限制性引物是在通用引物的GATC3'端分别加上一个碱基A?T?C?G,以下简称为引物A?T?C?G,引物序列如下:
引物
序列
A
5'-GGTTTGGCTGGTGTGGATCA-3'
T
5'-GGTTTGGCTGGTGTGGATCT-3'
C
5'-GGTTTGGCTGGTGTGGATCC-3'
G
5'-GGTTTGGCTGGTGTGGATCG-3'
(2)将引物A?T?C?G两两组合,共有10组,以接头与cDNA酶切片段的连接产物为模板,进行限制性分组PCR反应,反应条件如下:①97℃2分钟;②95℃30秒,65℃30秒,72℃1分钟,共35个循环;③72℃5分钟;④4℃保持?扩增产物在8%的变性聚丙烯酰胺凝胶中平行电泳?经EB染色后,在紫外灯下诱导前后的基因差异一目了然?
8.差异条带的回收
选取在正常中高表达的差异条带与诱导后高表达的差异条带切割出相应的凝胶块置于EP管中,用一次性的吸头尽量将凝胶挤碎?估计体积,加入1~2倍体积的洗脱缓冲液(0.5mol.L-1醋酸铵,10mol.L-1醋酸镁,0.1%SDS,1mmol.L-1EDTA,pH:8.0),在旋转平台上37℃洗脱12小时以上?4℃,12000×g离心1分钟,将上清转移至另一微量EP管中?加2倍体积的4℃的无水乙醇,冰上沉淀30分钟以上?4℃,10000×g离心10分钟,弃上清?加75%的乙醇洗涤沉淀,4℃,10000×g离心10分钟,加10μl水溶解?-20℃保存?
9.二次PCR
以上面得到的DNA为模板,相应的引物进行二次PCR扩增,反应体积50μl,反应条件同前?产物经2%的琼脂糖电泳鉴定?
10.二次PCR产物的纯化(参照QIAquickPCR纯化试剂盒说明)
将二次PCR扩增电泳显示为单一条带的PCR产物进行纯化,方法如下:在紫外灯下用干净的刀片将DNA切下?在无色的EP管中称重,每体积胶(100mg~100ml)加3体积的BufferQG?50℃水浴10分钟,为帮助溶解,每隔2分钟振摇一次,将上述溶液转移至另一套在2ml的收集管中的离心柱?室温,12000×g离心1分钟?弃洗脱液,再加入0.5mlBufferQG,室温,12000×g离心1分钟,弃洗脱液?在离心柱中加入0.75mlBufferPE,室温,12000×g离心1分钟?弃滤液,再离心1分钟?将离心柱放在另一1.5ml的EP管中,加入30μl的BufferEB至离心柱的膜中央,室温放置1分钟?室温,12000×g离心1分钟?将滤液置-20℃保存?
11.纯化后PCR产物与载体连接
将纯化的PCR产物与pMD18-TVector连接,操作按说明书进行:
pMD18-TVector0.5μl
PCR产物4.5μl
SolutionI5.0μl
16℃连接3小时?
12.转化JM109感受态细菌
13.阳性克隆的挑取?鉴定及扩大培养
14.目的基因片段的测序
15.生物信息学分析
差异片段测序后在因特网上登录NCBI的网址(https://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/),通过AdvanceBLAST程序进行同源性分析?在GeneBank中搜索是否有和所发现的片段同源的基因,测序结果及同源性比较见实验结果部分?
16.差异片段半定量RT-PCR鉴定
为了确定所筛选的EST是否是诱导过程中差异表达的基因,必须进行半定量RT-PCR鉴定?反应结束后,产物在2%琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下照相,密度扫描分析PCR产物带?
