一.用品
1.细胞培养或者提取组织
2.试剂的配制
（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶）
A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量）
10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 5ml（包括）
ddH2o 1.5ml
30% 储备胶 （0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺） 1.65ml
1.5mol/l Tris（PH 8.8） 1.25ml
10% SDS 50ul
10%过硫酸铵 50ul
TEMED 4ul
1%明胶 0.5ml
B.浓缩胶的配制
浓缩胶 3ml
ddH2O 2.1ml
30%储备胶 0.5ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.38ml
10% SDS 30ul
10%过硫酸铵 30ul
TEMED 3ul
（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）
（4）4 ×上样缓冲液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS（PH7.2） 8ml
16%甘油 3.2 ml
溴酚蓝 0.024g
ddH2o 2.4ml
(5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2， 1μmol/L ZnCl2，pH7. 6
漂洗液： 50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2， 1μmol/L ZnCl2，pH7. 6
（7）孵育液：50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2, 0. 02% Brij-35 ,pH7.6
（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝 R-250，30%甲醇，10%乙酸
（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%
二：步骤
1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与4×上样缓冲液（4%SDS，0.25 mmol/L Tris-HCl，40%甘油，0.1% 溴酚蓝）按照1∶3混合。
4.配制分离胶和浓缩胶，15ul/孔上样（根据表达强忍和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v恒压跑至分离胶和浓缩胶交界处改为90毫安恒流，直至溴酚蓝跑出胶外。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2， 1μmol/L ZnCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次45分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2, 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。
6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD） 和MMP -9（92 KD） 为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。
注意事项：
1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡 。
2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液 配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。
