在免疫组化过程中，为了更好的说明问题和查找原因，最好设置阳性对照片（已知的高表达相应抗原的组织）和阴性对照组织片（不加一抗但是加二抗系统/不加任何抗体两组），所有操作过程应完全一致。
染色弱或者没有染色（按照先后顺序，先排除一些简单的原因）:
可能原因
解决办法
试剂使用顺序错误或者漏加试剂
重复实验，保证每一步均正确
二抗和一抗不匹配
选择匹配的二抗
底物和酶不匹配
选用匹配的底物
酶失活
换用新的酶（将酶和底物混合，看是否显色？）
组织中没有待测抗原表达或者表达水平低
使用阳性对照片
抗体浓度太低
增加抗体浓度.最好使用不同浓度的抗体，决定最佳浓度
抗体孵育时间不充分
延长抗体孵育时间
底物孵育不充分
延长底物孵育时间
抗体储存不当，导致失效
将抗体分装，低温保存 (-20 to -70 C) ，避免反复冻溶。稀释抗体在4保存1-2周，避免时间过长。或者根据说明书进行恰当的保存
一抗失效
换用新的一抗
二抗失效
换用新的抗体（能否成功与其它一抗配合？）
脱石腊不充分
延长脱腊时间或者换用新的二甲苯
组织固定不充分或者不当
增加固定时间或者改用不同的固定方法
组织固定过度
减少固定时间。若已固定过度，则需使用正确的或者推荐的抗原修复方法
复染试剂与底物系统不匹配
选择正确的复染试剂（不加复染剂，看是否有组织染色？）
封片剂不正确
选择正确的封片剂
染色背景高:
可能原因
解决办法
洗片不充分
每步之间至少洗片3次
组织含有内源性的酶，如HRP/AP
在加入一抗之前使用3％的H2O2甲醇封闭内源性HRP活性，使用左旋咪唑(levamisole)溶液阻断内源性AP活性。或者换用葡萄糖氧化酶系统
组织含有内源性生物素（尤其是肾脏、肝和脾）
在加入一抗之前，血清封闭之后使用avidin/biotin阻断试剂。或者避免使用biotin-avidin系统或改用IF方法(直接将酶和底物加到组织片上，看是否显色？)
一抗的非特异性结合或者抗体浓度过高
增加一抗的稀释度
二抗和组织非特异性结合
使用与二抗来源相同的正常动物血清（一般是10％）封闭，必要时可以将血清浓度加大
组织固定不充分，抗原扩散
Increase duration of postfixation
使用小鼠来源的二抗检测小鼠组织
在加一抗之前使用MouseOnMouse封闭试剂
干片
染色过程中避免出现干片现象
染色强度过大:
可能原因
解决办法
一抗或者二抗浓度过高
降低抗体浓度。或者使用不同的浓度，决定最佳染色浓度
孵育时间过长
减少孵育时间
孵育温度太高
降低孵育温度，在4℃过夜或者 37℃0.5-1小时或者RT
底物孵育时间过长
减少孵育时间
干片
染色过程中避免出现干片现象
