第一节 蛋白质分离纯化与鉴定的基本原理
一、蛋白质的理化性质
（一）蛋白质的两性电离
pI：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为0，此时的溶液的pH称为~。
体内大多数蛋白质：pI≈pH 5.0。在pH 7.4，大多数蛋白质解离成阴离子。少数蛋白质为碱性蛋白质（如鱼精蛋白、组蛋白）和酸性蛋白（如胃蛋白酶和丝蛋白等）。
（二）蛋白质的胶体性质
1.蛋白质：生物大分子，MW：1~100万，大小：1~100nm
2.维持蛋白质胶体稳定因素
蛋白质亲水基团→吸收水分→水化膜 →防止蛋白质沉淀析出
蛋白质表面带有电荷→稳定胶体→防止蛋白质沉淀析出
（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固
1.蛋白质变性（denaturation）
2.蛋白质沉淀
（1）疏水测链暴露→蛋白质聚集→沉淀（变性）
（2）等电点或去水化膜→蛋白质沉淀（非变性）
3.复性（renaturation）与不可逆变性
（1）renaturation：蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原来的构象和功能，称为~。
（2）不可逆变性：蛋白质变性后，空间构象被严重破坏，不能恢复，称为~。
4. 蛋白质的凝固作用（protein coagulation）
蛋白质经强酸、强碱作用变性后，仍能溶解于强酸、强碱中，若将pH调节至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍能溶解于强酸、强碱中，这种现象称为~。
（四）蛋白质的紫外吸收
蛋白质：Tyr和Trp，280nm有最大吸收值，
故A280∝ protein浓度
（五）蛋白质的显色反应
1.茚三酮反应（ninhydrin reaction）
茚三酮 + 蛋白质 → 蓝紫色化合物（在570nm有最大吸收值）。
2.双缩脲反应（biuret reaction）
CuSO4 + protein or peptide → 紫色或红色
二、分离纯化蛋白质的意义
1.要研究某种蛋白质的结构与功能，生产高活性的蛋白质类激素、酶等，必须separation和purification。
2.在基因工程下游工作中，从“分泌型”的细胞质或从“包涵体”中获取具有生物活性的、纯度好的高蛋白质产品，需要separation和purification
三、蛋白质分离纯化的前处理
（一）生物样品的选择和处理
1.样品的选择：有效成分含量高、来源丰富、保持新鲜、实验条件恒定、取材工艺简单、有综合利用价值等。2.样品的处理
保存：-10℃冰箱临时保存，-20℃冰箱短期保存，-70℃冰箱长期保存。
预处理：包括去除脂肪、结缔组织等。
耐高温的成分：烘干长期保存。
有些样品可先冻干粉，再在冰箱中长期保存。
（二）细胞破碎
机械破碎法：研钵研磨、细菌磨、匀浆器、组织捣碎器、组织分散器。
物理学方法：超声波粉碎机、压碎挤压法、冻融法、渗透压法。
化学法：有机溶剂或表面活性剂→破坏细胞膜的磷脂结构，增加其通透性→导致整个细胞破碎→提取结合蛋白质和胞内酶。
酶学法：酶→降解细胞壁，例如：溶菌酶→降解肽多糖的β-1,4-糖苷键→降解革兰氏阳性菌。β-葡聚糖酶和蜗牛酶→破坏酵母菌的细胞壁。
（三）抽提（extraction）
1.定义：是指在一定条件下，用适当的溶剂和方法，使有效成分充分溶解到溶剂的过程。
2.抽提液应具备的条件：
对有效成分溶解度大、破坏性小
对杂质溶解度小或不溶解
来源广泛、价格低廉
操作安全等
3.抽提应控制的因素：
溶剂的 pH值 pH偏离pI，碱性蛋白质选用低pH，酸性蛋白质选用高pI，但pH不能过高或过低，以防蛋白质变性。
溶剂的离子强度和极性：A.盐溶液抽提时，离子强度较低促进蛋白质的溶解、保护蛋白质活性，离子强度过高则引起蛋白质的salting out。B.有机溶剂抽提脂蛋白、非极性基团较多的蛋白质和酶。
温度：0~10℃。
抽提液的体积：抽提液︰抽提物=3~5︰1。
添加保护剂：β-巯基乙醇、Cys、GSH→防止或延缓-SH氧化。EDTA→防止-SH和金属离子产生沉淀。酶的抑制剂：保护蛋白质不被水解。
四、蛋白质的鉴定
SDS-电泳法、等点聚焦电泳法、N-末端Aa残基分析、HPLC、沉淀分析、扩散分析等。
第二节 蛋白质的盐析与透析
一、盐析法与等电点沉淀法
1.盐析（salting out）
（1）定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高这种现象称为盐溶（salting in），但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析（salting out）。
（2）原理
Salting in：蛋白质吸附某种离子→蛋白质彼此排斥，而蛋白质与水相互作用加强→溶解度提高。
Salting out：大量中性盐加入→破坏蛋白质分子表面的水活膜，降低水的活度，蛋白质表面的电荷被中和→蛋白质相互聚集而析出。
（3）盐析中最常用的盐是：
(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4，尤其以(NH4)2SO4为最佳。
原因：(NH4)2SO4溶解度大而温度系数小，分离效果好，能保持蛋白质的天然构象，且价廉可得，这是蛋白质粗提纯的一种最常用方法。
（4）分级盐析的计算方法
A. 添加饱和(NH4)2SO4溶液
V = V0(S2－S1)/(1－S1)
其中V0为原来溶液的体积，单位为ml。
B.加固体(NH4)2SO4
W = B(S2－S1)/(1－AS2)
其中A、B为常数，与温度有关。W单位： g/L。
C.从有关“生物化学实验书籍”附录查询
2.等电点沉淀法
（1）pH 偏离pI时，蛋白质带相同符号的净电荷而互相排斥→蛋白质溶解度大。
（2）pH = pI时，蛋白质的净电荷为0→蛋白质聚集沉淀
（3）等电点沉淀法的缺点：沉淀不完全。
二、透析和超滤
1.透析（Dialysis）：
就是利用蛋白质分子不能通过半透膜（Semipermeable membrane）而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与小分子物质分开。
作用：脱盐、无机离子和小分子物质等。
透析膜：动物膜、羊皮纸、火棉胶、赛璐玢或其他材料等。
2.超滤（ultrafiltration）：
是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量的物质分离的技术。
Ultrafiltration的功能：纯化和浓缩（同PEG，聚乙二醇）。
Ultrafiltration膜：丙烯晴、醋酸纤维素、硝酸纤维素和尼龙等。
第三节 蛋白质的电泳技术（electrophoresis）
一、基本原理
1. 分子的运动速度与迁移率
（1）蛋白质分子在电场中的泳动速度（v）
F电场力 = (E/d) q；F阻力 = 6πrηv；
当F电场力 = F阻力时， (E/d)q = 6πrηv，
v = Eq/(6πrηd)。r：分子（半球）半径，
η：溶液 的粘度。
（2）迁移率（M）
M = v / (E/d) = (L/t) / (E/d) = dL / Et
2.影响迁移率的因素
样品：纤维状蛋白质和球状蛋白质具有不同的摩擦力→不同的迁移率。
缓冲液
①离子强度：0.05~0.1摩尔浓度（最适宜的离子强度）。
②pH：决定蛋白质带净电荷的多少。
支持介质 一般用比较惰性材料
①吸附作用 对样品有滞留作用，形成拖尾→带不清晰，分辨力降低。例如：纸的吸附作用强，醋酸纤维素可以消除这种现象。
②电渗作用 电泳缓冲液相对于固体支持介质的相对移动。
+++o++o++++ +++o++o++++
→
------------------- --------------------------
电渗的结果（造成的影响）：加速阳离子的前进，阻滞了阴离子的移动，但在一般实验中可以忽略不计。如需矫正，用中性分子（葡聚糖）的迁移程度来确定电渗的大小。
③分子筛作用 如凝胶电泳作用：有助于分子大小有所不同的生物大分子的分离。凝胶中交联度↑→孔径减小→大分子移动的阻力↑（与Sephadex凝胶过滤正好相反）。
二、电泳的类型
（一）按有无支持物分
1.不用支持物的电泳（自由界面电泳）：Tiselleas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦（密度梯度）技术、等速电泳技术等。
2. 用支持物的电泳：纸上电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、薄层电泳、非凝胶支持物区带电泳（支持介质有：淀粉、纤维素粉、合成树脂粉末等）、凝胶支持物区带电泳（支持介质有：淀粉胶、聚丙烯酰氨凝胶、琼脂糖凝胶等）
（二）从使用型式上分
水平式、垂直式、板形、柱形、双向电泳、连续电泳、电泳—层析相结合的电泳技术等。
三、醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）
1.醋酸薄膜的结构
纤维素的羟基乙酰化→形成纤维素醋酸酯→溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿等）涂抹成均匀的微孔薄膜（均一的泡沫结构，渗透性强）。
2.Cellulose acetate membrane electrophoresis优点：
电渗小、分离速度快、样品用样量少、分离清晰、无拖尾和吸附现象，染色的本底较浅可透明，便于保存和定量分析。
3.应用：
血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、同工酶、胎儿甲种球蛋白以及核酸等方面的检测，适合于医学和临床检验。
四、琼脂和琼脂糖凝胶电泳
1.结构及其特征
琼脂（agar）：红色海藻中提取出来的多聚糖复合物，具有相同的多糖骨架和不同的取代基（硫酸酯基、甲氧基、羧基等）。
琼脂糖（agarose）：取代基最少的一种多糖，其电渗作用远小于agar。
agar和agarose特征：容易制成各种形状的凝胶，容易掌握和保存，凝胶的均一性好、牢固、富有弹性、容易固定和干燥，干膜可长期保存。
2.agar or agarose gel electrophosesis优点
网孔大、液体多而近似于自由电泳；电泳速度快、区带整齐、分辩率高、重复性好；无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外线检测及定量分析。
3.应用
（1）分离血清蛋白、脂蛋白、同工酶等。
（2）与免疫化学结合，发展成免疫电泳技术。
（3）分离和鉴定核酸。
五、聚丙烯酰氨凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）
1.定义：是以人工合成的聚丙烯酰氨凝胶作为支持介质的一种电泳技术。
2. 聚丙烯酰氨凝胶的生成
3. 凝胶网孔的大小和适宜的凝胶浓度（%）
4.PAGE的分类及其功能特点
按形状：圆盘状和垂直板电泳
按凝胶是否一致分：连续电泳和不连续电泳，其中不连续电泳有较高的分辨力（具有电荷效应、浓缩效应和分子筛效应）。
5. PAGE的作用机制
样品胶（常省略）
浓缩胶（大孔胶）：蛋白质介于Cl－和Gly之间。Cl－和Gly之间形成低电导区→高电压梯度→加快蛋白质移动，且胶的孔径大，对蛋白质移动没有阻碍→蛋白质在快离子和慢离子之间被浓缩成薄薄的一层。
分离胶（小孔胶）：Gly在pH8.9下解离度聚增→泳动速度超过蛋白质→高电压梯度消失→蛋白质在均一的电压梯度和pH条件下分离；同时由于胶孔径小，具有分子筛效应→使具有相同电荷，只要分子量大小和形状不同的蛋白质得以分离。
6. PAGE优点及应用
优点：样品用量少，分辩率高
应用：科研、农、医及临床诊断。如蛋白质、酶、核酸的分离及病毒、细菌提取液的分析等。
六、SDS-PAGE
1.SDS及SDS-PAGE
（1）SDS：十二烷基硫酸钠（sodium decyl sulfate，SDS），一种阴离子去污剂，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种SDS—protein的复合物。
（2）SDS- PAGE：具有SDS的PAGE，分离SDS—protein复合物，通常把这种电泳称为SDS-PAGE。
2.SDS的作用
protein （四级结构） →SDS-protein subunit
SDS-protein消除或掩盖了不同种类蛋白质分子原来电荷的差异。
SDS- protein引起蛋白质构象的变化（变成长椭圆形，短轴长度都为1.8nm，长轴长度与蛋白质分子量成正比）。
因此蛋白质在SDS-PAGE 中的泳动率不受其原来电荷和分子形状的影响，只决定于分子量。
M = k·10-bm, lgM = lgk－bm = c－bm
3. SDS-PAGE应用
测定未知蛋白质的分子量（亚基）
纯度鉴定
生物分子配基是否脱落等。
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, a common technique for separating proteins at good resolution. The protein mixture first is treated with SDS, a negatively charged detergent that binds to proteins. This binding dissociates multimeric proteins and forces all polypeptide chains into denatured conformations with nearly identical charge:mass ratios. During electrophoresis, the SDS-protein complexes migrate through the polyacrylamide gel. Small proteins are able to move through the pores more easily, and faster, than larger proteins. Thus the proteins separate into bands according to their size as they migrate through the gel. The separated protein bands are visualized by staining with a dye.
七、浓度梯度聚丙烯酰氨凝胶电泳
1.浓度梯度PAGE的结构与功能特点：聚丙烯酰胺浓度由上到下形成由低到高的连续梯度，梯度凝胶内部的孔径由上而下逐渐变小，电泳后不同分子量的颗粒停留在与其大小相对应的位置上。
2. 浓度梯度PAGE的制作过程
3. 浓度梯度PAGE的应用：测定天然蛋白质的分子量；分离和鉴定生物大分子。
八、印迹转移电泳（electrophoretic blottransfer）
1.印迹转移电泳：通过凝胶电泳将分离的蛋白质再次经过电泳，转移到固相载体表面的过程，称为~。
2.转移蛋白质的固相载体：滤纸、硝酸纤维薄膜、醋酸纤维薄膜等。常用的是硝酸纤维薄膜，其强度好、化学性质稳定。
3. 印迹转移电泳装置
4. Electrophoretic blottransfer的应用（1）检测特定的蛋白质组分（2）寻找蛋白质的相应配（3）诊断疾病的工具。
Western blotting, or immunoblotting. (a) A protein mixture is electrophoresed through an SDS gel, and then transferred from the gel onto a membrane. (b) The membrane is flooded with a solution of antibody (Ab1) specific for the desired protein. Only the band containing this protein binds the antibody, forming a layer of antibody molecules (although their position can't be seen at this point). After sufficient time for binding, the membrane is washed to remove unbound Ab1. (c) In the development step, the membrane first is incubated with a second antibody (Ab2) that binds to the bound Ab1. This second antibody is covalently linked to alkaline phosphatase, which catalyzes a chromogenic reaction. Finally, the substrate is added and a deep purple precipitate forms, marking the band containing the desired protein.
九、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦：
带电的两性电解质（如蛋白质）在pH梯度中进行电泳，根据被分离物质等电点不同而进行分离的方法，又称电聚焦（electrofocusing）或聚焦电泳（focusing electrophoresis）。
2. 聚丙烯酰胺凝胶pH梯度的形成及其等电聚焦的原理
聚丙烯酰胺 + pK和pH各自相异而又相近的两性电解质
通电形成pH梯度
蛋白质样品（两性电解质）移动到其等电点的pH区域，并在此pH环境下聚焦
3.IEF的优点：
扩散作用小；加样区域不限；样品的过分稀释也对电泳不影响。
4.IEF的应用：
测蛋白质的等电点；蛋白质的微量分析；蛋白质的纯度鉴定；鉴定蛋白质构象是否改变，是否有脱氨基等现象。
十、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.双相电泳的操作过程
先作第一相电泳
将第一相电泳后的凝胶沿电泳方向纵切成薄的长条，然后埋于第二相电泳凝胶板中进行第二相电泳（两相的电泳方向是互相垂直的）。
如果两相电泳的pH值不同，必须将第一相电泳的凝胶条放在第二相电泳的缓冲液中预先浸泡。
2.应用：复杂的样品分析、观察蛋白质空间构象改变等电泳现象差异以及用作分析抗原抗体的双相免疫电泳等。
Preparation of a two-dimensional protein gel by isoelectric focusing (IEF) followed by SDS electrophoresis. Two-dimensional gel of protein extracts from cells growing in a medium. Each spot represents a single polypeptide;
polypeptides can be detected by dyes, as here, or by other techniques such as autoradiography. Each polypeptide is characterized by its pI (isoelectric point) and molecular weight.
Autoradiography. A radiation-sensitive photographic emulsion containing silver salts (AgBr) is placed over tritium-labeled cells attached to a glass slide (for the light microscope) or to a carbon-coated grid (for the electron microscope). The cell regions containing the labeled molecules emit radioactive particles, along the tracks of which silver is deposited. When the photographic emulsion is developed, the silver deposits appear as dark grains under the light microscope and as curly filaments in the electron microscope.
十一、免疫电泳（immunoelectrophoresis）
1.定义：是把琼脂电泳和免疫扩散结合起来用于分析抗原或抗体性质的一种检测方法。
2.免疫电泳的种类
微量免疫电泳（micro immunoelectrophoresis）
火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis）
交叉电泳（crossed electrophoresis）
亲和免疫电泳（affinity immunoelectrophoresis）
十二、染色方法
（一）蛋白质的染色
1. 氨基黑10B（amino black 10B或amidoschwarz 10B或naphthalene blue black 2B 200）
amino black 10B的分子式：C22H13N6S3Na3，MW=715，λmax=620~630nm，酸性燃料。
amino black 10B与protein结合的基团：磺酸基 + Pr→复合盐
缺点：灵敏度不高；着色点不等、色调不一，误差较大。
2.考马斯亮蓝R250（coomassie brilliant blue R250，CBB R250或PAGE blue83）
CBB R250分子式：C14H44O7H3S2Na，MW=824，λmax=560~590nm
结合蛋白质的原理：通过范德瓦尔键与蛋白质结合。
优点和缺点：灵敏度高（比氨基黑10B高5倍）；适用SDS-Pr染色，用于蛋白质微量分析。背景颜色深，定量不准确；对一些碱性蛋白质及低分子量蛋白质（如组蛋白）会从凝胶中洗脱。
3. 考马斯亮蓝G250
CBB G250分子式：CBB G250比CBB R250多二个甲基，MW=854，λmax=590~610nm
结合蛋白质的原理 同CBB R250
优点和缺点：同CBB R250，只是灵敏度不及CBB R250，但仍是amino black 10B的3倍；能选择地使蛋白质染色而几乎无本底色。
4.荧光染料
丹磺酰氯（dansylchloride，DNS-el）
原理：DNS-el + 蛋白质或氨基酸的NH2 →荧光性质→在320nm或280nm下 呈荧光区带或斑点
优点：蛋白质或肽经丹磺酰化后并不影响迁移率，不阻止蛋白质水解。
荧光胺（fluorescamine，fluram）
原理：同DNS-el
优缺点：没有荧光背景，易引起电泳迁移率改变（SDS可以消除此影响）。
2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮（MDPF）—同fluorescamine。
1-苯胺基-8-奈磺酸（ANS）：本身无色，但与蛋白质结合后，在紫外光照射下产生荧光。
5. 银染色法
原理：染色机制尚不清楚，可能与摄影过程中Ag+的还原相似。
优点：灵敏度高，是CBB R250的100倍。
6.广谱燃料（stains-all）染色法
染色配方及其染色程序
缺点：灵敏度低，SDS存在下不能染色。
（二）糖蛋白的染色
1.过碘酸-Schiff试剂
2.阿尔山蓝（alcian blue）
（三）脂蛋白的染色
1.油红（oil red）
2.苏丹黑B（sudan black B）
3. 亚硫酸品红：常用于醋酸薄膜脂蛋白电泳染色，生成紫红
色脂蛋白染色带。
（四）特异酶的检测
1.酶作为蛋白质，通过电泳，定位在凝胶某一位置。
2.酶催化某些化学反应→产生颜色很深的不溶性产物→指示
酶在凝胶中的位置。
