【目的和要求】
1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。
2. 了解蛋白质的两性解离性质。初步学会测定蛋白质等电点的方法。
3. 加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。
【实验原理】
（一） 蛋白质及氨基酸的呈色反应
蛋白质所含有的某些氨基酸具有特殊结构，可以与某些试剂反应，生成有色物质。
1. 双缩脲反应
尿素被加热至 180℃左右时，两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下可与Cu2+结合生成复杂的紫红色化合物。此反应称为双缩脲反应。
所有含有两个或两个以上肽键的化合物均有此反应。
蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应，可用此法鉴定蛋白质的存在或测定其含量。
2. 茚三酮反应
蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外，其他氨基酸生成紫红色，最终为蓝色化合物。
除蛋白质、多肽和各种氨基酸能进行茚三酮反应外，氨、β-丙氨酸和许多一级胺化合物都有此反应。该反应灵敏度达1：1500 000（pH5-7）。现已广泛地用于氨基酸定量测定。
3. 黄色反应
凡是含有苯基的化合物都可与浓硝酸反应产生黄色化合物。芳香族氨基酸及含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质分子具有此反应。苯丙氨酸很难反应，需加少量浓硫酸才有黄色反应。
(二) 蛋白质的两性反应及等电点的测定
蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。当溶液的pH值低于蛋白质等电点时，即在 H+ 较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子，当溶液的pH值大于等电点时，即在OH—较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。
本实验采用蛋白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，在等电点时蛋白质溶解度最小，最容易沉淀析出。
(三) 蛋白质的沉淀反应
蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。该反应可分为以下两种类型:
1. 可逆沉淀反应
在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉淀反应称为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用；在低温下，乙醇或丙酮对蛋白质的短时间作用以及等电点沉淀等。
用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。
沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度、种类不同，所以在不同条件下，采用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，这种方法称为蛋白质的分级盐析。它在酶的生产和制备等工作中被广泛应用。
2. 不可逆的沉淀反应
在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白质的性质，这时蛋白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中，这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超生波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中（对蛋白质等电点而言），蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属离子，如Zn2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+ 、Fe3+结合成蛋白质盐。在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐存在，当加入汞、铅、铜、银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解在水中，说明它已发生了变性。重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质; 临床上则用蛋白质解除重金属盐食物性中毒。但应注意，过量的醋酸铅或硫酸铜可使沉淀的蛋白质再溶解。
蛋白质在有机酸的作用下带正电荷，与酸根的负电荷结合成为溶解度很小的盐类而沉淀。三氯乙酸和磺基水杨酸最有效，可将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此得到广泛应用。
【实验试剂和器材】
（一）试剂
1. 卵清蛋白溶液：取5ml鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤,新鲜配制。
2. 0.5% 酪蛋白(以0.01N NaOH作溶剂)
3. 酪蛋白-醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25克，加蒸馏水20ml及1.00N NaOH溶液5ml (必须准确)。摇荡使酪蛋白溶解。然后加1.00N醋酸5ml ((必须准确)，倒入50ml 蒸馏瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于0.10N醋酸钠溶液内，酪蛋白的浓度为0.5% 。
4. 蛋白质-NaCl溶液: 取20ml蛋清,加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。
5. 0.5% 甘氨酸，0.3% 酪氨酸，0.5% 色氨酸
6. 尿素，双缩脲试剂，0.1%茚三酮乙醇溶液，浓硝酸，10%NaOH
7. 0.01%溴甲酚绿指示剂，0.02N HCl，0.02N NaOH，0.01N HAc，0.10 N HAc，1.00N HAc
8. 饱和硫酸铵溶液, 硫酸铵粉末, 2%硝酸银, 0.1%硫酸铜, 饱和硫酸铜, 10%三氯乙酸,
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（二）器材
试管及试管架，酒精灯，玻璃漏斗，滤纸，移液管，滴管，恒温水浴。
【实验方法】
1. 双缩脲反应
取少量尿素结晶，加入干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后加入10滴双缩脲试剂，混匀, 观察颜色变化。
另取1支试管，加入卵清蛋白溶液 1ml 再加入5滴双缩脲试剂，混匀，观察颜色变化。
2. 茚三酮反应
取 2 支试管，分别加入卵清蛋白溶液和0.5%甘氨酸溶液4滴 ，再加入2滴0.1% 茚三酮乙醇溶液，混匀，在沸水浴中加热 1-2 分钟，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨基酸呈色深浅。
3. 黄色反应
分别向 6 支试管中加入试剂，微火小心加热(不必沸腾)，观察颜色变化。再滴加 10% NaOH 溶液使呈碱性，观察颜色变化.
4. 蛋白质的两性反应
（1） 取 1 支试管，加入1ml 0.5% 酪蛋白和5-7滴 0.01% 溴甲酚绿指示剂（变色范围是pH 3.8—5.4，在酸性溶液中为黄色，在碱性溶液中为蓝色），混匀，观察溶液的颜色。
（2）用滴管缓慢加入 0.02N HCl 溶液，随加随摇，直到有大量沉淀产生。说明原因，并观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴入 0.02N HCl 溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，说明原因。
（4）再缓慢滴入 0.02N NaOH 溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化过程，说明原因。
5. 酪蛋白等电点的测定
取 9 试管编号后按下表顺序准确加入试剂。加入每种试剂后应混匀。（单位：ml）
静置约20分钟,观察每支试管内的混浊度,以-,+,++,+++,++++符号表示沉淀的多少。根据观察结果，指出哪个pH是酪蛋白的pI。
