本实验作为“大肠杆菌碱性磷酸单脂酶基因克隆、表达”的下游实验，通过对重组基因表达后的基因蛋白碱性磷酸单酯酶的提取、分离与纯化的实验操作，了解所涉及的生化技术中提取（细胞破碎）、分离（离心、盐析、过滤等）、复性（包涵体）、层析（凝胶与离子交换层析）、浓缩，与酶蛋白含量和酶活力检测、电泳鉴定及其相关的生物制备与分析的系列操作技术，并结合上游基因克隆与表达的实验操作，使学习与掌握运用这些生化技术制备生化物质的整个过程，以形成现代生物工程技术实际运用与操作的整体概念。
1 实验原理
碱性磷酸单酯酶广泛分布于原核及真核生物各组织中，一般存在于外周胞质中。与其它分泌蛋白一样，它是以前体的形式分泌的，在膜通道中最终形成成熟的碱性磷酸单酯酶，成为主要存在于质膜上的一种膜结合蛋白。哺乳动物中发现有四种该酶的同工酶，它们通过与GPI Anchor结合连接在细胞膜上。其中三种是组织专一性的，存在与胎盘，生殖细胞和肠内；另一种是非组织专一性的，被称为肝骨肾型同工酶。
碱性磷酸单酯酶以二聚体形式存在，每条单链47.05kD。这两条链的蛋白序列完全相同，但二级结构有细微差异。每条单链含两个锌离子，一个镁离子和一个磷酸基团，锌离子的作用是稳定酶的三级和四级结构，镁离子参与催化反应，磷酸基团是酶的配基。其中大约每克分子含有2克原子锌，而在该酶的活性中心含丝氨酸残基。碱性磷酸单酯酶的二聚体的沉降常数为6.2S。金属螯合剂可除去锌离子而使酶失活。该酶在6M尿素存在下，被硫醇作用产生可逆变性。除了Mg2+，其它金属离子如Mn2+ 、Ca2＋、Zn2＋等对酶也有激活作用。
碱性磷酸单酯酶是一种非特异性的水解酶，能水解磷酸单酯键，但不水解磷酸二酯键。它可作用于多类底物，如β-甘油磷酸、葡糖-1-磷酸，腺-磷酸、尿一磷酸和5-磷酸核黄素等。最适温度37℃，最适 pH10，对底物只具有相对的专一性，在碱性条件下水解磷酸酯：
单磷酸酯＋水→ 醇＋磷酸
它的抑制剂有二乙三胺五乙酸，N-双（2- 羟乙基）呱嗪-N-2（乙磺酸），乙二胺四乙酸（EDTA），邻二氮杂菲，巯基羧酸（如半胱氨酸，巯基乙酸等），焦磷酸盐。氰化物是该酶的强烈抑制剂。
当溶液pH低于3时，该酶释放出锌离子形成单体而失活。该酶对热较稳定，85℃加热30分钟仍保留活性，当有Mg 2＋存在时可增加酶的热稳定性。
本实验采用上游实验载入克隆的碱性磷酸单酯酶基因phoA的大肠杆菌作材料，从培养的菌体中提取、纯化碱性磷酸单酯酶。该菌体表达的碱性磷酸单脂酶以分泌于周质间隙的可溶性蛋白和以包涵体的形式分泌的蛋白组成，可通过细胞破碎以及细胞破碎后溶液的离心来分别获得这二种蛋白。
细胞破碎即指采用一定方法，在一定程度上破坏细胞壁和膜，设法使胞内产物最大程度释放到液相中。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。细胞的破碎根据作用方式不同，基本可以分为两大类：机械法和非机械法。本实验采用的超声波法属于机械法。即输入高能超声波破碎细胞，由于超声波的空穴作用引起的冲击力和剪切力可以使细胞破碎。空穴作用是在超声波作用下经历气泡形成、长大和破碎，在气泡破碎期间，大量声能被转化成机械能，引起局部的剪切使细胞破碎。
细胞破碎液中可溶性蛋白，采用盐析方法加以纯化。
根据不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同而利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出的方法称为蛋白质的盐析。蛋白质水溶液中，蛋白质分子表面的亲水基团能与水进行水合作用，同时水分子受蛋白质极性基团的影响，定向排列在蛋白质周围将蛋白质包围起来，形成由多层水分子构成的水化层。水化层使蛋白质颗粒分开，不会相聚生成大的颗粒而沉淀。蛋白质是兼性分子，在偏离蛋白质等电点的溶液中，蛋白质分子表面同种电荷相斥，也在防止蛋白质颗粒聚集而沉淀。这种蛋白质分子内和分子间极性基团电荷的静电引力，当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子极性基团的共同影响，使蛋白质在水中溶解度增大；当盐浓度增加一定程度时，随盐与水形成的水化离子的增加，致使这部分水被电解质夺走，从而夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐溶时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐的浓度可使各种蛋白质分段产生沉淀。蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的是硫酸铵。
本实验采用硫酸铵分段盐析方法，除去可溶性蛋白液中的部分杂蛋白。初步纯化蛋白再利用层析法进一步纯化。
层析法利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术，是目前广泛应用的一种分离技术。层析法中所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，由固体物质组成；另一是流动相，由可以流动的物质组成。当流动相中待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于固定相与流动相间各组份的理化性质存在的差异，使两相间各组份发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同。随流动相在固定相间移动，两相中各组份之间发生相互作用。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快；反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。利用随流动相在固定相间移动时的各组份之间发生相互作用次数的加大而差异增大，从而达到将各组份分离的目的。该实验采用Sephadex G-75凝胶的凝胶层析法
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凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质具有保护作用。对于高分子物质有很好的分离效果。Sephadex G属于交联葡聚糖凝胶，其商品名为 Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G- 25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。Sephadex具有不同交联度的网状结构，其颗粒内部的孔径大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到．因此它具有分子筛效应。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。用它作为填充料制成层析柱，可以根据被分离物质的大小进行分离。已有不同型号的葡聚糖凝胶用于不同物质的分离。当流动相中的蛋白质混合样品在凝胶颗粒间流动时，比凝胶颗粒孔径大的蛋白质分子不能进入凝胶网格内，被排阻在凝胶颗粒的外部；比凝胶颗粒孔径小的蛋白质分子则能进入到网格内部，小分子蛋白质的下移速度落后于大分子的蛋白质，从而使样品中分子大的蛋白质先流出色谱柱，中等分子的蛋白质分子滞后，小分子量的蛋白质分子最后流出，以次达到分离效果。
本实验从细胞破碎后溶液的离心沉淀而获得包涵体。包涵体是指细菌表达的重组蛋白在表达过程中由于缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。包涵体一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA 聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约 1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体中的重组蛋白虽然具有正确的一级结构（即氨基酸序列），但其立体结构是错误的，所以缺乏生物学活性，加上细胞破碎时剧烈的处理条件，也使蛋白的高级结构破坏，因此要获得具有生物学活性的重组蛋白，重组蛋白的复性是必要的。复性过程是当重组蛋白被溶解于变性剂如尿素、盐酸胍等溶液中其一级结构（即氨基酸序列）处于完全伸展的解聚状态时，通过缓慢去除变性剂使重组蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。从而使重组蛋白重新产生正确配对的二硫键而进行折叠复性，恢复天然构象，获得生物学活性。复性过程一般在尿素浓度4M左右时开始，到2M 左右时结束；对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程结束。重组蛋白的复性是十分复杂的过程，可能由于去除变性剂的方法不当，蛋白质重新无规则聚合，生成二聚体、三聚体或多聚体，甚至形成变性沉淀物，而使复性率较低。目前有较多的包涵体蛋白的复性方法。较常用的有稀释复性、透析复性、柱上复性等方法。该实验采用稀释复性方法。将包涵体溶解液缓慢地直接加入复性液中得到复性。
复性后的包涵体蛋白溶液中除了含有目的蛋白，还有不少杂质，本实验中采用离子交换层析——DEAE-32纤维素凝胶层析——进行进一步的分离纯化。
离子交换层析是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异而予以分离的技术。该技术从使用天然的有机化合物一结晶硅铝酸钠（俗称泡沸石）作为离子交换剂时起，已经历了半个多世纪。 随着高分子化学的发展，采用了不溶性高分子化合物作为离子交换剂即离子交换树脂，使得这一技术迅速发展。离子交换层析是吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和力等物理、化学过程发生综合作用的结果。在实际应用中，常根据使用的目的而灵活地突出上述因素中的一种，使之起主导作用。例如把大分子物质（如蛋白质）和小分子物质（如各种无机盐类）分离开，往往突出穿透这一性质，选择交联度大（孔隙极小）的交换剂，使大分子不能进入交换剂内部而达到分离的目的。又如，活性炭具有强大的吸附能力而能从许多杂质中把目的物吸附住，但它又伴随着吸收作用使之洗脱困难造成损失。而这种吸收作用却使我们能利用它来除去产品中的热源物质和色素。因为考虑到离子亲和力，常有目的地把交换剂处理成H＋型、Na+型、 NH4＋型、Cl-型、OH-型等。在选择离子交换剂时必须考虑几种因素：被分离物质带何种电荷、被分离物质分子的大小、被分离物质所处的溶液环境、尤其是环境中是否共存有其它离子、这些离子是何电性与数量、被分离物质的物理和化学性质（如是否耐酸、碱、及高温等）、被分离物质的总量、有何种离子交换剂及其性能如何等。只有充分考虑到被分离物质与离子交换剂在离子交换层析时互相的各种作用，才能更好地应用离子交换技术。
DEAE- 纤维素（离子交换纤维素）作为一种离子交换剂，是在纤维素分子上结合一定的离子基团而制成的。由于纤维素是开放性的长链，有较大的表面积，而且纤维素上离子基团数量不多，排列疏散。它比一般离子交换树脂网孔大、溶胀性强、亲水性强和不易引起生物活性物质失活等特性，离子交换纤维素具有以下优点：（1）对蛋白质的交换容量（吸附容量）较其它离子交换剂大；（2）分辨力强，分离效果好；（3）样品回收率高；（4）因吸附时结合力弱，洗脱条件比较缓和（盐离子强度和pH轻微的改变）不致影响生物大分子的活性。因此，以离子交换纤维素为固定相的柱层析技术已成为蛋白质、酶等生物大分子分离纯化的最常用手段之一。
离子交换纤维素分为阳离子交换纤维素，阴离子交换纤维素。其中又分强酸性、弱酸性、强碱性、弱碱性离子交换纤维素。最常用的有DEAE—纤维素（弱碱性阴离子交换剂）、羧甲基—纤维素（弱酸性阳离子交换剂）和磷酸—纤维素（强酸性阳离子交换剂）。DEAE—纤维素（弱碱性阴离子交换剂）可分为三种类型：粗纤维型（交换容量较低）、纤维型（由粗纤维型经改良）、微颗粒型纤维素。如DEAE—32系为微颗粒型纤维素，其纤维素糖链之间通过氢键连接成微晶区，同时有少量氢键形成无定形区，将纤维素经过化学处理除去无定形部份，同时又以表氯醇为交联剂，制成微颗粒型纤维素。它具有结构紧密、电荷密度大、交换容量大和流动性能好等特点，适用于对分辨力要求较高的层析柱分离。
由于离子交换剂的交换能力常用交换当量来表示（一股商品注明的交换当量是指酸碱当量，常用每克干物质具有的离子基的毫克当量数表示），但这不同于蛋白质的吸附容量。因有的蛋白质分子不能进人内部，离子交换剂虽然有较高的离子交换当量但对蛋白质的吸附容量却很小。在实际选择离子交换纤维素时常用每克离子交换纤维素干粉所能吸附蛋白质的克数代表吸附容量。并根据分离蛋白质的总量、离子交换纤维素的吸附容量来选择层析柱的大小（－般挑选短粗柱，柱直径和柱长的比例常为1：4、1：5等）。
在离子交换纤维素柱层析中，缓冲液的选择也是非常重要的，应注意：
1．缓冲液离子应不影响被分离物质的溶解度，或与一些必要的保护剂如Ca 2＋、Mg 2+等发生沉淀。
2．缓冲液离子应不影晌被分离物质，或干扰其活力的测定。
3．因为纤维素的交换当量小，为了降低盐离子的竟争，吸附时缓冲液的浓度要尽可能的低（0.001—0.01M）。当确定了该物质能被吸附后，可提高离子强度，以保持较高的缓冲能力。
4．选用的缓冲液pH首先决定于被分离物质的等电点，用阴离子交换剂时，要用高于该物质等电点的pH值；用阳离子交换剂时，则要用低于该物质等电点的pH值；同时考虑被分离物质在此pH 状态下的稳定性和溶解度。当洗脱PH值确定后，即可选择某一种缓冲液作为洗脱剂。
离子交换层析中选择改变洗脱液浓度梯度以提高洗脱能力是较常用的洗脱方法。梯度洗脱（gradient elution）中，从交换剂上把各种组分洗脱下来所使用的梯度是最重要的控制参数。洗脱液的浓度梯度可以单纯用增加缓冲液的浓度来达到，这样便于控制pH值。特别是当用同一pH梯度时，由于远离其PK＇值以致缓冲能力降低时，加大浓度可以提高缓冲力。当缓冲剂溶解度有限或价格昂贵时，可以加入中性盐（如氯化钠、氯化钾等）、或改变盐浓度的梯度以提高洗脱能力（改变盐浓度的梯度洗脱法是常用的）。洗脱液的体积（与柱体积之比）和洗脱液中盐浓度的变化形式都直接影响层析柱的分辨率。梯度洗脱是一种把流经层析柱的溶液的盐浓度作连续恒定地改变的机械方法。可以采用的梯度形式有五种：阶梯性、线性、凸面性、凹面性、复合性。阶梯性梯度在大规模的制备中应用最多，它是在一室容器中依次用连续增加浓度的溶液来洗涤离子交换树脂所形成的；线性、凸面性、凹面性梯度是用二室混合器调节二室容积比例形成的；复合性梯度是用一种多室混合器产生的。采用何种梯度形式最为理想，应根据分离制备的要求而定。本实验中选用的是一般最常用的是线性梯度洗脱的形式。
该实验通过梯度洗脱收集的溶液，采用透析袋的分离膜性质使之浓缩。由于分离膜依据膜内平均孔径而具有选择透过特性，所以它可以使溶液中具有不同分子大小的混合物质有的通过、有的被截留而使之分离。膜分离过程根据不同的分离推动力，如静压力差、浓度差、电位差等，使各种膜分离过程具有不同的机理和适用范围。生物领域应用的膜分离法主要有透析、反渗透、超滤、微滤、电渗析等。各种膜分离过程及其膜的孔径选择应根据被分离对象的分子与溶液情况来选择。透析膜也是一种半透膜，它是根据溶质分子的大小和化学性质的不同而具有不同透过速度的选择性透过膜，通常用于分离水溶液中的溶质。该实验是利用透析袋的这种特点，用吸收剂从透析袋外吸出袋内溶液中的水分子，溶液中的蛋白质大分子，无法透过透析袋的半透膜被阻挡，从而使溶液中蛋白质达到浓缩的目的。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开，常用的有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等。
本实验利用SDS-PAGE 来检测碱性磷酸单酯酶样品的纯度。SDS-PAGE——十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种利用阴离子表面活性剂SDS去除不同蛋白质分子之间的电荷差异，而主要根据分子筛效应进行电泳分离技术。当蛋白质溶液中加入SDS与巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质结合质量比为1.4:1。由于十二烷基硫酸根带负电荷，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。 SDS与蛋白质结合后，还可以引起构象改变。蛋白质－复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆榜。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18Å。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量，各种SDS-蛋白质在电泳时产生的泳动率的差异大小，就反映了其分子量的大小。如果被检测的酶含有不同分子量的亚基，那么即使是纯酶，SDS凝胶电泳仍会按亚基分子量的大小显示出多个条带。因此，其主要用途可分离蛋白质或测定其亚基的分子质量。
最后，本实验在重组蛋白提取、纯化的整个蛋白分离过程中，通过检测蛋白溶液中相对蛋白含量与相对酶活力来评价蛋白溶液的纯化效果。
蛋白质中的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸含有苯环结构，可吸收紫外光，在λ= 280 nm时有最大吸光值。因此，在λ(波长) = 280 nm下，蛋白质溶液的吸光值与溶液中蛋白质的含量成正比，可通过测定溶液的280 nm处吸光值来检测溶液中蛋白含量。
另外，根据碱性磷酸单酯酶能催化磷酸酯水解的性质，采用对硝基酚磷酸二钠（NPP）为底物，碱性条件下在碱性磷酸单酯酶的作用下水解成对硝基酚和磷酸。
在碱性溶液中，对硝基酚盐离子在λ(波长) = 405 nm处有强烈的吸收峰，而底物没有这种特性。利用这一点可以定量测定产物的生成量，从而检测酶活力。
2 实验部分
2.1菌体收集，细胞超声破碎，包涵体洗涤、溶解、复性
2.1.1试剂及器皿：
1、 0.01mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液
2、试管、离心管、10ml烧杯、角匙
3、超声波仪、低速离心机、低温高速离心机、震动仪
4、包涵体溶解液：8 mol/L尿素
5、包含体复性液：0.01 mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液 + 1mmol/L氧化型谷胱苷肽 + 1mmol/L还原型谷胱苷肽的混合液，＋1mM Mgcl2
+0.16 M 尿素
6、滴管、试管、烧杯、玻棒、透析袋、震荡仪、低温高速离心机等
2.1.2实验步骤：
1、 将重组菌的培养液（100ml）置于离心杯中，4000r/min，常温离心20min，分别收集菌体,置于塑料离心管，－20度保存。
2、 在重组菌中加入 4ml 0.01mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液，搅拌混匀。
3、 将上述菌体悬浮液盛放在10ml小烧杯中，冰浴条件下在超声波仪中进行细胞破壁，超声波仪设定：功率400w、 工作5s，间隔5s，工作80次。
4、 将细胞破壁液置于塑料离心管中，低温高速离心机，于4℃、12000r/min、离心20min。
5、 将离心后的上清液倒入另一试管，测定酶活后－20度保存。
6、在包涵体中加入6ml去离子水，搅匀洗涤后，放入低温高速离心机，于4℃离心、12000r/min、离心20min，倾去上清液。同上再重复洗涤一次，保留沉淀。
7、沉淀中加入1ml包含体溶解液（8 mol/L尿素），搅匀后，置入冰箱放置，溶解2小时。
8、 从冰箱中取出包涵体溶解液，放入低温高速离心机，于4℃离心、12000r/min、离心20min，取上清液。
8、 在烧杯中加入包涵体复性液100ml。用滴管吸取上清液，冰浴条件下缓慢地滴入100ml包涵体复性液中，同时用玻棒轻轻搅匀（整个过程控制在30－60 min左右）。用薄膜封住烧杯杯口，放入冰箱，复性 48小时左右，测活。
2.2 离子交换层析：DEAE—32纤维素凝胶层析
2.2.1试剂及器皿
1、1.0 mol/L HCl
2、 1.0 mol/L NaOH
3、缓冲液Ⅰ：0.01mol/L PH8.0 Tris-HCl（ 1mM Mgcl2 +0.16 M 尿素）
4、缓冲液Ⅱ：0.01mol/L PH8.3 Tris-HCl（1mM Mgcl2 +0.16 M 尿素＋1M NaCl）
5、试管、100ml烧杯、玻璃搅棒、层析柱、梯度洗脱仪、部分收集器等
2.2.2 实验步骤
1、 DEAE—32纤维素预处理
1)取100ml烧杯，称取5克DEAE—32纤维素，加去离子水50ml，浸泡溶胀24 小时。
2)倾去凝胶溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0 mol/L HCl液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡0.5小时处理后倾去。用去离子水洗涤至中性。
3)倾去凝胶上层的水后，加入凝胶等体积的1.0 mol/L NaOH液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡0.5小时处理后，用去离子水洗涤。洗涤过程中，用倾去法除去细颗粒。其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分用力搅拌，以防止颗粒破碎），放置数分钟，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉。悬浮3-5次，直至上层没有细颗粒为止，再浸泡水洗至PH中性。
4)重复步骤2
5)倾去凝胶上层的水后，再加入凝胶等体积的0.01mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液Ⅰ，用搅棒轻轻搅动平衡。倾去凝胶上层的Tris-HCl缓冲液，重复平衡3次。
6) 将DEAE—32纤维素凝胶（Tris-HCl缓冲液Ⅰ）溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡。将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入盛有Tris-HCl缓冲液Ⅰ烧杯中。
2、装柱
1） 层析柱（1.0×50cm）用水清洗干净，柱的上、下端联接塑料管接上小乳胶管，装上螺旋夹。将层析柱垂直装好。打开柱上端口，从柱底下出口管朝柱内注入水，使柱底全部充满水而不留气泡，关闭柱出口。最终柱内留存有 1/4-1/5的水。从出口处接上一根直径2㎜细塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。
2） 轻轻搅动凝胶溶液（切勿搅动太快，以免空气再逸入），使形成均一的薄胶浆，并立即沿玻棒倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然沉降，待柱底面上积起约1-2㎝的凝胶床后，打开柱出口水流。随着柱内水的流出，上面不断加入凝胶液，使形成的凝胶床面上有凝胶连续下降（如果凝胶床面上不再有凝胶颗粒下降，应该用搅拌均匀地将凝胶床搅起数厘米高，然后再加凝胶，不然就会形成界面，影响层析效果）。
3） 当凝胶沉积到柱的顶端约3㎝处，停止装柱，让柱内水面高于凝胶床界面1㎝左右。
4） 用眼睛观察柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。若层析柱不均一，必须重新装柱。
3、平衡
柱装好后，使层析床稳定 15-20分钟，然后连接洗脱瓶出口和层析柱顶端，用3-5倍体积的0.01mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液Ⅰ平衡层析柱。平衡过程中控制上柱缓冲液的进柱操作压保持恒定。保持流速每滴/10秒。直至流出液的PH与上柱缓冲液Ⅰ完全相同,或测定上下缓冲液电导一致。
4、吸附与洗柱：
将包涵体复性液样品上柱，预留样品测定酶活和蛋白浓度。
上柱完毕后，用 0.01mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液Ⅰ洗柱，至流出液中不含蛋白物质（测A280数值，以0.01mol /L PH8.0 Tris-HCl缓冲液为空白对照，A280数值控制在0.02以下）。
5、洗脱：
1) 将梯度洗脱仪和层析柱连接好。
2) 在梯度洗脱仪中的洗脱瓶A（混合器）和洗脱瓶B（贮存器）内各装入100毫升缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ，注意两洗脱瓶，特别是液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内的气泡。
3) 开动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。
4) 将洗脱瓶A、洗脱瓶B与层析柱上端连接管道打开，同时将层析柱下端连接部分收集器，开始用部分收集器收集洗脱流出液。
5) 控制洗脱流速，收集洗脱流出液约25-30管（2毫升/管）
1、 对每个收集管进行A280与酶活力的测定。
1） 将上述收集管洗脱液依序编号。
2） 酶蛋白相对含量测定：
上述收集管洗脱液依序编号后，用0.01mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液作空白对照，直接读取A280测定值。（可用0.01mol /L PH8.0 Tris-HCl缓冲液调整溶液的合适稀释浓度，使测定溶液的A280测定值控制在0.10-1.0之间，读取A280测定值。）
3） 碱性磷酸单酯酶酶活力测定：
以对硝基酚磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对硝基酚量测定酶活力。在37℃、pH10.0条件下，每分钟转化产生1μmol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位。已知对硝基酚的摩尔消化系数E：E405 1cm =18.8 x 103。
上述收集管洗脱液依序编号。对应于上述收集管，取一组试管编号，各加入250ul 0.02mol/L对硝基酚磷酸二钠，750ul、 PH10.0、0.1M Na2CO3—NaHCO3的底物缓冲液，混匀，在水浴37℃预热5分钟，加入 50ul洗脱液，立即混匀后，37℃保温反应20分钟。立即加入0.5ml 0.5mol/L NaOH溶液，停止反应
空白对照管:同时取一试管，加入250ul 0.02mol/L对硝基酚磷酸二钠，750ul PH10.0 0.1M Na2CO3—NaHCO3的底物缓冲液，再加入 0.5ml 0.5mol/L NaOH溶液，混匀，在水浴37℃预热5分钟，加入50ul缓冲液或去离子水，立即混匀后，37℃保温反应20分钟。
将反应后的试管与空白对照管（如有沉淀，3500转/分离心15分钟，取离心清液），于分光光度计中测定A405值。（同时可用去离子水调整溶液的合适稀释浓度，使测定溶液的A405测定值控制在0.10-0.70之间，最后读取A405测定值。）
※相对酶活力 ＝A405 测定值× 稀释倍数＝A405值/ml
注：可直接以A405/ml值代表单位体积中碱性磷酸单酯酶相对酶活力。
1、 各管酶活较高的收集液合并，测定总体积，精确测定酶活性，并用考马思亮蓝测定蛋白浓度。
考马思亮蓝测定蛋白浓度测定请见附录。
8、浓缩
用滴管小心将“样品A8”管液装入透析袋（用橡皮筋先后扎紧两端）。透析袋放在表面皿上，适量铺洒聚乙二醇。将透析袋内溶液浓缩至1ml左右时，用滴管小心将透析袋内溶液吸入小试管内。（待用）
2.3 Sephadex G-75凝胶层析
2.3.1试剂及器皿：
1、 0.01mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液（1mM Mgcl2+0.16 M 尿素）
2、底物溶液：0.02mol/L对硝基酚磷酸二钠(简称NPP)
3、底物缓冲液：0.1mol/L（PH10.0）Na2CO3—NaHCO3 缓冲液
4、试管、试管架、石英比色皿、普通比色皿、100ml烧杯、玻璃搅棒、抽滤瓶、洗耳球、层析柱（1.0×50cm）等
2.3.2实验步骤：
1、Sephadex G-75凝胶预处理
1) 100ml烧杯，称取5克 sephadex G-75，加入50ml去离子水，浸泡溶胀24小时。
2) 倾去sephadex G-75溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0 mol/L NaOH液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡1小时处理后倾去。用去离子水洗涤。洗涤过程中，用倾去法除去细颗粒。其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分用力搅拌，以防止颗粒破碎），放置数分钟，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉。浮选3-5次，直至上层没有细颗粒为止，再浸泡水洗至PH中性。
3) 将Sephadex G-75凝胶水溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡。将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入烧杯中，其中盛有1/2去离子水。
2、装柱
1）层析柱（1.0×50cm）用水清洗干净，柱的上、下端联接塑料管接上小乳胶管，装上螺旋夹。将层析柱垂直装好。打开柱上端口，从柱底下出口管朝柱内注入水，使柱底全部充满水而不留气泡，关闭柱出口。最终柱内留存有1/4-1/5的水。从出口处接上一根直径2㎜细塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。
2） 搅动凝胶溶液（切勿搅动太快，以免空气再逸入），使形成均一的薄胶浆，并立即沿玻棒倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然沉降，待柱底面上积起约1-2㎝的凝胶床后，打开柱出口水流。随着柱内水的流出，上面不断加入凝胶液，使形成的凝胶床面上有凝胶连续下降（如果凝胶床面上不再有凝胶颗粒下降，应该用搅拌均匀地将凝胶床搅起数厘米高，然后再加凝胶，不然就会形成界面，影响层析效果）。
3） 凝胶沉积到柱的顶端约3㎝处，停止装柱，让柱内水面高于凝胶床界面1㎝左右。
4） 眼睛观察柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。若层析柱不均一，必须重新装柱。
3、平衡
柱装好后，使层析床稳定15-20分钟，然后连接洗脱瓶出口和层析柱顶端，用3-5倍体积的缓冲液平衡层析柱。平衡过程中控制上柱缓冲液的进柱操作压保持恒定。保持流速每滴/10秒。直至流出液的PH与上柱缓冲液完全相同。
1、 样品洗脱
a)上样准备：
a)上样前打开层析柱上端，先检查凝胶床界面是否平整，如果倾斜不平整，可用玻棒将凝胶床界面轻轻搅起后，再使凝胶自然沉降，形成平整状态的凝胶床界面。用毛细吸管小心吸去大部分清液，然后让液面自然下降，直至几乎露出凝胶床界面。
b)样品放入高速离心机，12000r/min、离心10min。
b) 样品上样：
1.用吸管将样品非常小心地滴加到凝胶床面上，注意不要将床面凝胶冲起。同时打开层析柱下面流出液开关（控制流速1滴/20秒），保持层析柱下面流出滴速与上样的滴速一致，控制凝胶床界面不能脱水，并控制样品区带尽量狭窄。
2.当样品全部加入后，用1-2ml的0.5 mol/L PH8.0 Tris-HCl洗脱液同上样时一样地保持层析柱下面流出滴速与上样的滴速一致以控制凝胶床界面不能脱水，小心清洗凝胶床界面表面，使黏附着的样品全部洗入凝胶床。
3.然后开始控制上样的滴速大于层析柱下面流出滴速，使几乎与凝胶床界面相平的洗脱液液面慢慢提高至离凝胶床界面高出2cm左右，封闭层析柱上端。
4.保持层析柱上柱洗脱液入口处与层析柱下面流出处具一定势压。控制上柱缓冲液的进柱操作压保持恒定。
c) 洗脱：
用0.1 mol/L PH8.0 Tris-HCl 缓冲液洗脱，控制洗脱流速1滴/20秒-30秒之间，用部分收集器收集，每管/30分钟（约1.5ml/管），收集约1—20管。
2、 酶蛋白含量（浓度）及酶活性检测
a) 将上述收集管洗脱液依序编号。
b) 酶蛋白相对含量测定：
上述收集管洗脱液依序编号后，用0.01mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液作空白对照，直接读取A280测定值。（可用 0.01mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液调整溶液的合适稀释浓度，使测定溶液的A280测定值控制在 0.10-1.0之间，读取A280测定值。）
c) 碱性磷酸单酯酶酶活力测定：
以对硝基酚磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对硝基酚量测定酶活力。在37℃、pH10.0条件下，每分钟转化产生1μmol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位。已知对硝基酚的摩尔消化系数E：E405 1cm =18.8 x 103。
上述收集管洗脱液依序编号。对应于上述收集管，取一组试管编号，各加入250ul 0.02mol/L对硝基酚磷酸二钠，750ul、 PH10.0、0.1M Na2CO3—NaHCO3的底物缓冲液，混匀，在水浴 37℃预热5分钟，加入50ul洗脱液，立即混匀后，37℃保温反应20分钟。立即加入0.5ml 0.5mol/L NaOH溶液，停止反应
空白对照管:同时取一试管，加入250ul 0.02mol/L对硝基酚磷酸二钠，750ul PH10.0 0.1M Na2CO3—NaHCO3的底物缓冲液，再加入0.5ml 0.5mol/L NaOH溶液，混匀，在水浴37℃预热5分钟，加入50ul样品溶液（取已测定的酶蛋白相对含量约处于收集管洗脱液中平均水平的那一管液），立即混匀后，37℃保温反应20分钟。
将反应后的试管与空白对照管（如有沉淀，3500转/分离心15分钟，取离心清液），于分光光度计中测定A405值。（同时可用去离子水调整溶液的合适稀释浓度，使测定溶液的A405测定值控制在0.10-0.70之间，最后读取A405测定值。）
※相对酶活力 ＝A405 测定值× 稀释倍数＝A405值/ml
注：可直接以A405/ml 值代表单位体积中碱性磷酸单酯酶相对酶活力。
10、将各管酶活较高的收集液合并，测定总体积，精确测定酶活性，并用考马思亮蓝测定蛋白浓度。
考马思亮蓝测定蛋白浓度测定请见附录
11、将以上合并样品置透析袋浓缩，以备走电泳。
12、以收集管每管洗脱液体积为纵坐标，分别以酶蛋白相对含量（浓度）A280/ml、碱性磷酸单酯酶相对单位酶活A405 /ml绘制层析图谱。
2.4 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.4.1试剂及器皿：
1、30％丙烯酰胺溶液：
取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加水至100ml，过滤，棕色瓶内避光4℃保存。
2、1.5 mol/L Tris-HCl分离胶缓冲液，PH8.8：
取18.15gTris，用lmol/L HCl调pH至8.8，加水至100ml，于4℃保存。
3、 1.0 mol/L Tris-HCl浓缩胶缓冲液，PH6.8：
取12gTris,用lmol/L HCl调pH至6.8，加水至 100ml，于4℃保存。
4、电泳缓冲液（PH8.3）：
取28.8g甘氨酸，6.04g Tris，加1Oml 10％SDS，加水至lL，室温保存。
5、10％ SDS溶液：
取1Og SDS，加水至100ml，完全溶解后室温保存。
6、10％ 过硫酸铵溶液：
取O.lg过硫酸铵，加水至lml，,每次用前新鲜配制。
7、 样品处理液（2 X）
水： 4.0 ml
浓缩胶缓冲液（PH6.8）： 1.0 ml
甘油： 0.8 ml
10％ SDS： 1.6 ml
2–巯基乙醇： 0.4 ml，
0.025％（W/V）溴酚蓝： 0.2 ml。
（上述溶液混匀后即可）
8、 染色液：含0.25％考马斯亮蓝R-250，50%乙醇，7%乙酸的水溶液
9、 脱色液：含30%乙醇，7%乙酸的水溶液
10、电泳玻璃板、电泳电源架、电泳槽、电泳仪等
11、低分子量蛋白标准品等
2.4.2、实验步骤：
1、分离胶和浓缩胶配制
按下表比例分别配制分离胶和浓缩胶。
组 分 分离胶（ml） 浓缩胶（ml）
双蒸水 3．05 1．22
30％丙烯酰胺 2．5 0．26
分离胶缓冲液（PH8.8） 1．9 ——
浓缩胶缓冲液（PH6.8） —— 0．5
TEMED 0．026 0．02
10％SDS 0．075 0．02
10％过硫酸铵 0．013 0．02
总体积 7．6 2
上表所列是用于制成1块胶板所需组份的量（分离胶与浓缩胶配制应随用随配）
2、凝胶板的准备
1）洗板：
将洗洁精用温水稀释后，用它浸透海绵擦洗二块玻璃板，然后用自来水洗净，再用酒精将板擦干。
2）配板：
将二块玻璃板叠放整齐，用夹子两边夹好，下沿两边角可用凡士林封住缝隙，将这二块玻璃板固定在底座上。插入配套梳子，在梳子下缘划线，指示灌胶位置。拔去梳子。
3、灌胶
a) 分离胶：
在分离胶的配置烧杯中按配比加料，最后加入TEMED，混匀后，利用滴管将分离胶（避免气泡产生）滴入二块玻璃板之间，至液面达到梳子下缘线1cm处。用滴管缓慢地加入正丁醇或水，注意不要冲乱胶面。静置，待分离胶聚合后，用滤纸吸去无水乙醇层。
2）浓缩胶：
在浓缩胶的配置烧杯中按配比加料，最后加入TEMED，混匀后，即刻用滴管滴加浓缩胶（避免气泡产生）覆于二块玻璃板之间的分离胶之上至满，轻轻插入梳子。静置待其凝结后，即制成凝胶板。用笔在梳子形成的凝胶凹口部位作好记号，指示样品点入时位置。
4、样品处理
分取样品0.5ml于各EP管中，加入等体积样品处理液。混合后，将EP管插入泡沫塑料浮板中，于100°C沸水浴中保温5分钟，取出冷至室温。
5、电泳
将二块玻璃板制成的凝胶板上的夹子卸去，擦掉下沿两边角的凡士林。
将凝胶板垂直靠在电泳槽里的电源架上，使凝胶板的凹沿面靠向电源架。通常两块凝胶板共用一个电源架。
将凝胶板与电源架按要求固定于电泳槽内。按要求加入电泳缓冲液，使分别加入在两块凝胶板中间电源架内的电泳缓冲液与加入在电泳槽中的电泳缓冲液互不相通。轻轻地拔去凝胶板内的梳子。
取处理后的样品液，用微量进样器吸取适量样品液，将样品液缓缓加入凝胶板内的凹口部位（样品点入处）。注意不要冲散样品。
用二根导线连接电泳糟与电泳仪，注意红色与黑色电极的插头和插口相配。接通电源。控制电压 80-100V（此时电流约6-10mA左右）。电泳时观察凝胶板上的样品溴酚蓝的色条带走至近底端1cm时，停止电泳。关闭电源。然后从电泳槽内小心取出凝胶板。
6、染 色：
用刀片或薄板将凝胶板外的两块玻璃板轻轻撬开，使凝胶倾伏在其中一块玻璃板上。
用刀片在凝胶上沿分离胶与浓缩胶的交接处，将分离胶切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品顺序。
然后将分离胶小心移入染色器皿中。
在染色器皿中加入100ml染色液，加盖，染色3小时。
7、脱 色：
将染色液倒去。染色的凝胶用水漂洗数遍，沥干水后置于染色皿中，再加入1OOml脱色液，加盖，脱色至染色的凝胶经脱色后能清晰显示出蛋白条带止。
8、制膜：
将凝胶片照相后，置于厚滤纸上，于真空中干燥保存。
2．5实验报告
1．根据层析数据（A280、 A405），绘出酶蛋白、酶活力层析图谱。
2．将碱性磷酸单酯酶纯化过程绘制一张纯化表。
3．展示实验中各种样品的电泳图谱。根据电泳图谱中各实验样品的电泳条带，观察各样品泳道相应位置中的蛋白变化，并进行分析。
4．根据在实验的每一步操作过程中所观察的实验现象，结合实验结果，进行全面的实验分析。
5．在综合分析、讨论的基础上，结合相关专业知识，尝试设计一条新的纯化工艺。
2.6 附录
采用考马斯亮兰法测定溶液中的蛋白浓度
考马斯亮兰法测定蛋白浓度是基于酸性溶液中，染料考马斯亮兰G-250 (Coomassie brilliant blue G-250)与蛋白质结合后，其吸收高峰从465nm移至595nm 处，而颜色也由棕黄色转为深兰色。因蛋白质与染料生成复合物颜色的深浅与其浓度成比例关系，故可作为测定蛋白质浓度的方法。本方法使用方便，反应时间短，染色稳定，且对显色时间不严格要求，并有抗干扰性强的特点，为常用的蛋白浓度测定方法。
测定方法如下：
（1）蛋白标液: 准确称取结晶牛血清白蛋白50mg，用0.9%NaCl溶液配成浓度为400mg/ml的溶液(临用前配制)。
（2）显色液：称取考斯亮兰 G-250 400mg，置于玻璃研钵中，加入0.5ml高氯酸研磨约30分钟后，再加入1.0ml高氯酸，继续充分研磨至完全溶解。加入约194ml水 4.5ml高氯酸，混匀，用三角漏斗过滤。以3%的高氯酸溶液将滤液在465nm处的吸光度调至1.3-1.5之间（1cm比色杯）。避光存放显色液。
(3)标准曲线制作:
各管混匀后，以蒸馏水作参比，测定各管在波长595nm和波长465nm处吸光度A值。计算Ai=OD595/OD465之值，以Ai’=Ai-A1为纵坐标，蛋白浓度为横坐标，绘制蛋白浓度标准曲线。
(4)样品测定:
用0.9% NaCl溶液将蛋白溶液稀释到20-40mg/ml。取1.0ml蛋白溶液，加入1.0ml显色液，混匀。参照标准曲线的制作方法测定OD595 和OD465之值，并计算Ai’=Ai-A1，于标准曲线上查出对应蛋白浓度。
(5)注意事项:
考马斯亮兰显色液应存放在棕色瓶内，避光保存；标准曲线每隔一段时间应重新校正；最好将样品浓度稀释到20-40mg/ml之间。
