1、集落的种类：
不同细胞来源的集落其形态和大小均有所不同.
2、各种集落的培养步骤：
各种造血细胞集落的培养条件有所不同，但其培养过程大致相似，操作步骤大致如下。
分离所要培养的细胞，制成单个核细胞悬液。
配制相应的培养体系。按比例将细胞因子、营养素以及血清等加入到培养 基中形成特有的培养体系，培养体系最好在37℃水浴中保温10min。
将琼脂等支持物煮沸融化，如是甲基纤维素则不需此步骤，待融化的支持 物温度降到40℃时，加入培养系混匀。
将充分混匀的培养体系加入培养皿或培养板的孔中，一把种3个复孔。
将培养皿或培养板置于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。
观察结果，不同的集落计数的时间有所不同，详见下述。
3、粒-单核-巨噬系细胞集落的培养：
以往CFU-GM培养的刺激物多用人白细胞、胎肌以及胎盘裂解液作为条件培养基等，现多用造血生长因子替代。这些细胞因子包括GM-CSF、G-CSF、M-CSF以及IL-3等，但常用GM-CSF。培养基多用IMDM，RPMI等，培养基常用琼脂以及甲基纤维素，但效果前者较好。
培养体系包括20%-30%胎牛血清，50ng/mlGM-CSF，细胞悬液中细胞总数一般以（1-2）X10^5/ml为宜，其余用IMDM或RPMI补齐，但保持琼脂终浓度为0.3%，甲基纤维素终浓度为0.9%-1.0%。细胞一般置于直径为33mm的培养皿或6孔板中，于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。
（1）集落计数 一般培养10-14天观察集落，大于40个细胞的细胞团为一个集落。
（2）集落形态一般CFU-GM的形态分3种。
致密型细胞紧密成团，细胞个体较小，对为粒细胞为主的集落。
混合型细胞团中央为紧密成团的粒细胞，周围弥散分布着单核细胞或巨噬细胞。
松散型细胞团比较均匀地分散，细胞个体较大，多为单核细胞和巨噬细胞组成。
4、红系集落的培养：
（1）集落培养体系CFU-E的培养需要EPO，BFU-E的培养需要PHA-LCM、再生障碍性贫血患者血清或IL-3等，培养基主要为IMDM，几种培养体系见表6-5.
（2）培养方法配制好的体系加入直径为33mm的培养皿或6孔板中，37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。
（3）集落计数一般CFU-E在培养的第5-7天观察计数，大于8个细胞的细胞团为一个CFU-E集落。BFU-E在培养的第14天计数，大于50个细胞组成的细胞团或3个中心以上的细胞团为一个BFU-E集落。
（4）集落的鉴定在倒置显微镜下，CFU-E及BFU-E集落一般呈鲜红色，易于和其他集落比较。
应用集落染色法进行鉴定。因为红细胞的血红蛋白具有类似过氧化物酶的作用，可使二甲基联苯胺和过氧化氢反应而形成棕红色，借此可与其他集落相鉴别。
首年称取1g二甲基联苯胺，融解于100ml无水乙醇中，配制成1%二甲氧基联苯胺溶液，再配制H2O2工作液，即在0.9ml的蒸馏水中加入0.ml75% H2O2。
染色工作液的配制：每5ml1%的二甲氧基联苯胺溶液中加入H2O2工作液0.2ml并混匀。染色时首先在培养物中加入适量的PBS或生理盐水，10-15min后，加入染色工作液，染色10-15min后，在倒置显微镜下观察计数染色成红色的集落为红系集落。
直接用吸管取出单个集落图片进行鉴定。首先用酒精灯或酒精喷灯在玻璃滴管前端1cm处，加热弯曲成直角，在滴管内吸取少许等渗液，在倒置显微镜下轻轻吸去单个集落，并吹至用多聚赖氨酸处理过的玻片上，轻轻涂开晾干。滴加1%二甲基联苯胺，3min，后滴加3% H2O2作用1min。蒸馏水漂洗，再用苏木素染色6min，1%盐酸酒精脱色5min，水洗干燥后镜下观察。红系集落染色后胞浆呈橘黄色。也可用单克隆抗体进行酶标鉴定。如应用血型糖蛋白A等。
5、巨核细胞集落的培养：
巨核细胞含量较低，集落不宜鉴别。其集落培养的刺激物只要有TPO、IL-3、IL-6、SCF、PHA-LCM以及再生障碍性贫血患者的血清等。主要培养体系见表6-6.
上述培养体系用培养基补足后加入培养皿或培养板的孔中，于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养7-14天，进行CFU-Meg集落计数，<3个细胞为一个CFU-Meg集落。培养21-24天，进行BFU-Meg集落计数<50个细胞或3个中心以上为一个BFU-Meg集落。集落鉴定：简要介绍应用直接酶标法对血浆凝块法培养的CFU-Meg集落进行鉴定的方法。
在培养皿或培养板的孔的培养物中加入甲醇/丙酮（1：3），固定20min，PBS漂洗，然后室温干燥，不及时染色时可置-20℃保存。
用含2%马血清的PBS室温孵育15min后吸去血清。
滴加10-20ul鼠抗人的IIb/IIIa单抗（一抗），室温孵育1h，PBS漂洗2次。
滴加10-20ul生物素结合的兔抗鼠二抗，室温孵育30min，PBS漂洗2次，
将标本浸于含1%过氧化氢甲醇溶液中，室温孵育1h，以消除内源性过氧化物酶，再用PBS漂洗2次。
滴加ABC试剂，孵育40min后予以充分洗涤。
DBA显色10min，PBS洗2次。
苏木素染色2min，水洗后自然干燥，镜鉴。阳性细胞为棕红色或棕黑色。
6、混合集落的培养：
混合集落是指集落中含有两系、三系和四系细胞的集落，一般是指三系以上的集落。培养方法预计培养体系与BFU-E和CFU-Meg相似，一般于14-18天观察。
7、高增殖潜能集落形成细胞的培养：
HPP-CFC是比较原始的造血祖细胞，在骨髓中含量极低，其生物学特性有以下几点。
可重建受致死剂量照射小鼠的骨髓造血。
具有想粒系、红系、巨核系以及巨噬系等多项分化的能力。
具有抵抗体内外细胞毒药物5-FU的作用。
由于其含量极低，所以应用富集和分选的CD34+细胞进行培养。培养体系各家报道不一，包括单层支持物培养法、双层培养法、高血清培养法、低血清培养法以及无血清培养法等，其集落培养的刺激物多由早期作用银子SCF、IL-3或IL-6以及晚期作用因子GM-CSF等组成。
（1）支持物培养法FBS40%、α-硫代甘油1X10-4mol/L、人转铁蛋白1mg/ml、柠檬酸铁铵10ug/ml、SCF100ng/mlIL-3 100U/ml、GM-SCF 10ng/ml、G-CSF 500U/ml、M-CSF500U/ml、EPO 3U/ml，CD34+细胞为1X102个。
（2）双层支持物培养法底层培养基（1ml）含SCF50ng/ml、IL-3 115ng/ml、IL-1 12ng/ml、M-CSF 500U/ml、以及0.5%的琼脂。上层体系含有0.3%琼脂以及适量的细胞。将上层接种在底层上，于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养28天时进行集落计数。
（3）无血清培养体系此体系中主要含有卵磷脂160ug/ml、胆固醇96ug/ml、人转铁蛋白600ug/茂雷、BSA15mg/ml、IL-3 400U/ml、EPO 2U/ml，上述体系用IMDM培养基配制，甲基纤维素总浓度为1.2%。
（4）高血清培养体系30%FBS、5X10-5mol/Lα-巯基乙醇（α-ME）、50ng/ml SCF、20ng/ml IL-3、20ng/ml GM-CSF，CD34+细胞为1X103个，甲基纤维素总浓度为1%。
上述体系加至直径为35mm的培养皿或6孔板中，于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养28天时进行集落计数。一般的HPP-CFC集落肉眼可见，集落直径大于0.5mm，集落含有数万个细胞，细胞密集成团。HPP-CFC集落近年来备受人们关注，因为其分化程度低于CFU-MIX，属于较为早期的造血祖细胞。HPP-CFC具有部分的自我复制和增殖分化能力，因此，可进行二次接种，二次集落形成率以及形成CFU-MIX的能力明显的高于一次接种的CFU-MIX。HPP-CFC既有造血重建和多向分化能力。为研究造血干细胞移植过程汇总移植物以及造血干细胞扩增产物的造血重建能力提供了良好的模型。
8、长期培养起始细胞的培养
LTC-IC是指培养5周以上造血细胞集落的综合，是由Sutheland等于1990年培养Dexter建立的长期培养体系中细胞时发现的，LTC-IC含有基质细胞层培养体系中可维持造血数月。在人类常常骨髓中其含量约为5X103个/L，在CD34+细胞中约占1-2%。
（1）培养体系12.5%胎牛血清和马血清（HS）、5X10-4mol/Lα-ME、10-6mol/L氢化可的松、400mg/L L-谷氨酰胺、40mg/L肌醇以及10mg/L叶酸。
（2）培养过程首先建立经射线照射的骨髓基质细胞层，再加入分离的MNC或分选纯化的CD34+细胞。每周半量换液一次，5周后，收集所有悬浮细胞以及用胰酶消化的黏附细胞一起接种于家肌纤维支持的集落培养体系中进行集落培养，测定各种造血祖细胞集落数。
9、成纤维细胞集落的培养
成纤维细胞是骨髓造血微环境基质细胞的一个重要的细胞成分，通过对成纤维细胞的研究可以了解骨髓造血微环境的情况。因此，CFU-F为研究骨髓造血微环境提供了一个良好的模型。由于成纤维细胞容易生长且很容易融合成块，一次随着培养时间的延长，集落计数往往较困难。一般采用7天计数较为适宜。培养体系如下：1X10^6/ml细胞接种于10ml含20%胎牛血清，10-6mol/L的氢化可的松的RPMI培养基中。细胞一般培养于容积为100ml的培养瓶中，37℃、5%CO2以及饱和湿度环境下，培养7天计数时，6个以上细胞的细胞团为一个CFU-F；培养14天计数时，40个以上细胞的细胞团为一个CFU-F。也可在培养瓶中置一小的无菌的玻片，以便进行细胞化学染色。CFU-F细胞镜下呈梭形或椭圆形，呈放射状或不规则散在排列。姬姆萨染色胞浆丰富呈蓝色，核为紫色，可见3-4个核仁。碱性磷酸酶以及a-奶粉醋酸酶染色为阳性。吞墨试验阴性，借此可与巨噬细胞鉴别。
10、白血病细胞集落的培养
白血病细胞集落的培养可应用于白血病细胞药物敏感试验以及白血病细胞体外净化效果的研究。根据白血病类型不同，其集落培养体系也有所不同。主要分为急性髓细胞白血病集落（CFU-AML）和急性淋巴细胞白血病集落（CFU-ALL）两种.
(1) CFU-AML的培养由于CFU-AML的培养体系同时也促进T淋巴细胞集落（CFU-T）的生长，为了避免后者对结果的影响，一般在CFU-AML的培养时应去除T淋巴细胞，尤其是在白血病的缓解期，方法如下。
制备克脑迷（AET）处理的1%绵羊红细胞。
常规分离单个核细胞，调整细胞浓度为1X10^7个/ml。
单个核细胞中加入等量的经AET处理的1%绵羊红细胞，再加入10%FBS，混匀，37℃孵育15min，再500r/min离心5min，置4℃2h。
混匀上述细胞，缓慢加至淋巴细胞分离液上，1500r/min离心20min，吸取界面细胞，PBS洗涤2次，用含10%FBSde IMDM洗涤2次，调整适当的细胞浓度备用。
将上述体系滴加至直径为35mm的培养皿或6孔培养板中，37℃、5%CO2以及饱和湿度环境下培养8天使进行集落计数。在琼脂培养体系中50个细胞以上的细胞团即为一个CFU-AML，而在甲基纤维素培养体系中20个细胞以上的细胞团即为一个CFU-AML。
（2）CFU-ALL的培养CFU-ALL的培养可采用双层半固体培养法以及无血清培养法。但是，分离的耽搁核细胞需去除T细胞。去除T细胞可采用E-玫瑰花结法、尼龙棉法、以及补体融解法等。
双层培养法。底层饲养层一般用2X10^5个/ml正常人外周血单个核细胞接种于含15%胎牛血清，0.5%琼脂的McCoy-5A培养基中。上层为2X10^5个/mlALL去T细胞的单个核细胞，接种于含15%胎牛血清，25U/ml IL-2，2.5%PHA,7.5X10-5mol/La-ME,0.8%甲基纤维素的McCoy-5A培养基中。上述体系培养于直径为35妈妈的培养皿或6孔培养瓶中，37℃、5%CO2以及饱和湿度环境下培养7天使进行集落计数，50个细胞以上的细胞团即为一个CFU-ALL。
无血清培养法。将2X10^5个/mlALL去T细胞的单个核细胞，接种于含10mg/mlBSA,1ug/ml人转铁蛋白，8ug/ml胰岛素，10%PHA-LCM以及0.8%甲基纤维素的IMDM培养基中。细胞一般培养于直径为35mm的培养皿或6孔培养板中，37℃、5%CO2以及饱和湿度环境下培养7天使进行集落计数，50个细胞以上的细胞团即为一个CFU-ALL。
