家兔椎间盘(intervertebral disc)细胞的体外培养方法

2010-02-22 14:37 · jim

Material :  1. 培养皿、培养瓶、烧瓶、试管等。  2. 分离组织需要的眼科剪子、眼科镊子。  3. 5%CO2孵箱、PH计、95%氧气源。  4. 36电动恒温水浴。  5. 培养液、各种缓冲液及添加剂DMEM高糖培养基、Hank’s缓冲液 、20%胎牛血清,转换生

 

 

Material :

  1. 培养皿、培养瓶、烧瓶、试管等。

  2. 分离组织需要的眼科剪子、眼科镊子。

  3. 5%CO2孵箱、PH计、95%氧气源。

  4. 36电动恒温水浴。

  5. 培养液、各种缓冲液及添加剂DMEM高糖培养基、Hank’s缓冲液 、20%胎牛血清,转换生长因子(TGF-β1)(5ng/mL)、胰岛素-转铁蛋白-硒(10ug/mL胰岛素,5ug/mL转铁蛋白,和0.5ng/mL亚硒酸盐)青霉素100U/Ml,链霉素100U/ml。

  6. 消化液 胶原酶(collagenase) 200U/ml 0.4%台盼兰、0.25胰蛋白酶。

  Method 1 组织块法

  1. 取材:空气栓塞法处死家兔后,在无菌状态下获取家兔椎间盘组织。置于准备好的DMEM培养基(含双抗)。迅速带回到无菌超净台上。(注意事项:椎间盘位于相邻两个椎体之间,取材过程较为繁琐,要求动作迅速,争取在家兔死后半小时内完成,否则,该组织对缺氧耐受性差导致培养失败)。

  2. 剪切:在超净台上,进一步将周围组织分离,用Hank’s液冲洗数遍,直到冲洗液透明为止。眼科剪刀将组织修剪为1~2cm3大小的小组织块,Hank’s冲洗干净。 加入少量含血清的培养液。(组织块不宜过小,否则不容易爬出足够数量的细胞)

  3. 接种:用吸管吸取小组织块入培养瓶底部,摆放均匀,一个25cm2的培养瓶可放置10-15个小组织块,翻转培养瓶,加入少量培养液。4~6小时后,待组织块充分贴壁后,再翻转回来(动作一定要轻巧,以免刚刚贴壁的组织块脱离瓶底) 。

  4. 置于5%CO2孵箱中培养,每隔3天换液。待细胞95%融合时,0.25胰蛋白酶传代分瓶。

  Method 2 消化法

  前面步骤同组织块法1,2。

  (3)组织块再进一步剪切,此时培养液中最好不加血清。完毕后,加入消化液,移

  入到10ml 离心管,培养箱内消化。每隔20分钟,用吸管吹打一次,观察液体有

  否变浑浊,并取少量液体,在相差倒置显微镜下观察。0.4%台盼兰染色计算活细

  胞数目。接种密度在105数量级。置于5%CO2孵箱中培养,每隔3天换液。待细

  胞95%融合时,0.25胰蛋白酶传代分瓶。

 

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