1 材料
新西兰乳兔；新生牛血清、DMEM、Ⅱ型胶原酶。
2 方法
新西兰乳兔(雌雄不限，共18 只，分6 次处理)，溺死，置于75%酒精溶液中10 分钟，拿入超净工作台，自眼外眦至耳屏前剪开皮肤暴露皮下组织，再次严格消毒，自外眦外将颧弓由根部剪断，暴露髁状突，去净髁状突表面软组织及软骨膜，以眼科剪剪取髁状突表面的透明软骨，以磷酸缓冲液(PBS含青霉素、链霉素各100 U/L)冲洗2 遍，将软骨剪切成1-3 mm3左右碎块，0.25%胰蛋白酶先消化30-35 分钟，PBS浸洗 2 遍；后置于50 ml玻璃培养瓶，加0.1% Ⅱ型胶原酶(DMEM配制)，37℃消化3.5－4.5 小时，每小时置 37℃恒温振荡箱振荡5 min。直到软骨块大部分呈肉眼可见的絮状物，倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，以弯头吸管轻轻吹打，细胞悬液以1200 rpm离心7 分钟，弃上清，以含10%新生牛血清DMEM 的培养液终止消化，离心弃上清以洗去细胞表面的酶，再以DMEM悬浮细胞并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90%左右。将细胞以2×105/ml接种于25 cm2培养瓶内，置于37℃恒温，5% CO2浓度，饱和湿度培养箱内培养。2 天后换液1 次，以后隔天更换培养液，倒置显微镜观察、照相记录细胞形态及贴壁生长情况。待细胞贴壁达到85%－90%后传代。
待细胞贴满壁后传代：传代时，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞2 次，培养皿内加入0.25%胰蛋白酶－0.01% EDTA(1:1)消化液，以覆满瓶底为限，置温箱2～3min后，显微镜下观察到细胞质已回缩，细胞间隙增大，即向培养皿里滴入2 mL左右含血清的培养液终止消化，收集第1 代培养细胞，用弯头吸管吸取混和液，反复多次轻吹皿底细胞，使细胞彻底从培养瓶底壁脱落，收集细胞混和液，1200 rpm离心7 分钟，弃上清，以含10%新生牛血清的DMEM清洗细胞3 次，制成细胞悬液，将细胞以2×105/ml接种于25 cm2培养瓶内，置于37℃恒温，5% CO2浓度，饱和湿度培养箱内培养。隔天更换DMEM培养液。以第3 代软骨细胞制成细胞悬液并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90%，调整细胞浓度为5×107/ml，用于实验。
传代：吸干培养液，用PBS 液轻洗细胞2 次，培养皿内加入0.25 %的胰蛋白酶，以覆满皿底为限，置温箱2～3min后，显微镜下观察到细胞质已回缩，细胞间隙增大，少部分细胞已浮于消化液中，用吸管吸取混和液，反复多次轻吹皿底细胞，使细胞彻底从培养皿底壁脱落，收集细胞混和液，离心，用PBS 液漂洗2 次，再制成细胞悬液，计数，检查细胞活力，按每个培养皿接种2×105个细胞再培养。
