1 材料
1.1 动物
24 小时内新生的SD 大鼠10 只。
1.2 试剂
F12 完全培养液(含F12 培基、15%胎牛血清、青链霉素等)，0.25%胰蛋白酶，0.1%Ⅱ型胶原酶(Sigma，
F12 培养基配置)。
1.3 器械
手术器械和磁力搅拌器。
2 方法
拉颈处死 24 小时内新生的SD大鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出头盖骨，分离顶骨和额骨，冰生理盐水液反复洗涤大鼠乳鼠颅盖骨标本除去脂肪组织及残留血，放入另一盛有F12 完全培基液的培养皿中再洗涤，将颅骨剪成2～5 mm2碎片，将洗涤过的骨碎片用0.25%胰蛋白酶2 ml预消化15 min，以清除纤维组织细胞，弃去上清液(其中主要含成纤维细胞)。
然后以 0.1% Ⅱ型胶原酶10 ml，在37℃环境中消化20 分钟，室温下磁力搅拌消化20 分钟。静置数分钟，收集消化液，室温下以1200 rpm离心10 分钟。去除上清液，用20%胎牛血清的F12 培养液4 ml悬浮细胞，接种于75 ml培养瓶中，补培养液8 ml使每瓶液体量达到12 ml；对静置后沉淀部分可再重复以胶原酶消化20 分钟、磁力搅拌消化15 分钟、离心10 分钟，将获得的3 瓶细胞放置于二氧化碳培养箱，在5% CO2，95%空气，37℃温度下培养，24 小时后可见细胞贴壁生长，胞质开始伸展，换新鲜培养液，以后每隔 48 小时换培养液(注：消化视具体情况而定，也可多消化1 遍)。
原代培养一般接种后第 7 天能长满。传代时，取生长良好、贴壁松紧适度的成骨细胞1 瓶，弃去培养液，传代时先以PBS 冲洗2 遍，加0.25%胰酶1 ml，室温下消化3～5 分钟，将胰蛋白酶液弃去，加F12培养液充分吹打8-10 分钟。将已消化的细胞收集、合并，计数；用F12 完全培基调节至细胞浓度为合适浓度。一般取2-5 代成骨细胞进行实验。代数太多，细胞老化或者分化明显。
3 结果
如图所示，成骨细胞的形状和成纤维细胞非常相似，但是不同的是，比成纤维细胞更不容易消化，尤其是传代次数多，细胞老化的时候，非常难消化，并且不易消化成单个细胞。
成骨细胞 100倍
成骨细胞形成的矿化结节
鉴定的方法可采用碱性磷酸酶(ALP)活性检测、骨玻璃样蛋白(BGP)检测和矿化结节检测等。
4 讨论
成骨细胞包绕在硬组织中，致使处理困难，可采用骨组织块法、酶消化法、酶消化法、骨膜组织块法、骨髓培养法以及薄层骨片经EDTA 处理并经胶原酶消化，均可培养出成骨细胞。体外培养的成骨细胞保持有骨组织细胞的某些特征。
据文献报道，不同方法培养的成骨细胞形态是不同的[1]。
参考文献
[1] 司徒镇强. 细胞培养 [M]. 第一版. 西安. 世界图书出版社西安公司. 2000:115.
