1 材料
眼科剪刀 1 把,眼科镊子2 把,离心机,5 mL 小皿,10 mL 大皿,1×PBS 约200 mL,M199 培养液。
2 方法
2.1 在超净台内用10 mL 的离心管分装5 mL 的1×PBS(已高压灭菌);
2.2 手术台上取患者发生动脉粥样硬化改变的病变动脉,分放入准备好的PBS 中,拿回实验室在超净台中,无菌条件下剥去外膜,用手术刀片刮去内膜,留下中膜并将其剪成1×1 mm 大小组织块;
2.3 消化法:PBS清洗组织块后并将其转移入10 mL的离心管,加入0.125%胰酶消化(37℃)30 分钟,室温吹打100 分钟或者振荡器振荡100 分钟,待组织块变小且消化液变粘时,收集消化液配平以1500 rpm离心10 分钟后,收集细胞种植于预先加入M199 培养液的5 mL小皿中放入37℃、5%CO2的培养箱中;
2.4 贴块法:PBS 清洗组织块后移入已准备好的10 mL 大皿中,块间距为0.5 cm,放入培养箱中,3 小时后,待组织块贴壁后,再加入2 mL 培养液后放回培养箱中;
注意:最后加入 2 mL 培养液时应使其顺无组织块的皿边缘缓慢流下,勿使组织块吹下。
2.5 随后每3 天予以半量换液。
3 结果
一周后可见组织块周围有细胞爬出,大约 3 周后80%融合。