1 材料
1.1 取材
新鲜脐带(无菌的广口瓶，内装预冷的PBS，并加上200 U/ml青链霉素)，产后4 h内最佳，一定不要超过24 h，实验前保存在4℃冰箱中。
1.2 试剂
0.1%的I型胶原酶(用培养基配成，如DMEM、M199均可)；培养液(M199、50 μg/ml ECGF、20%胎牛血清、100 U/ml青链霉素、2 mmol⋅L-1谷氨酰胺、100 U/ml肝素钠)，也可以选择其它的生长因子。平衡盐液(生理盐水或者PBS或者D-hanks’液)；1%明胶PBS。
1.3 器械
烧杯(脐带数＋2)、止血钳(脐带数×2＋2)、镊子2把、手术直剪(脐带数×1)、12号粗针头(去尖，打磨光滑，脐带数×1)、玻璃培养皿。
2 方法
2.1 明胶包被培养瓶过夜，取出明胶，用2 ml培养液(含10%血清的普通培养液)冲洗培养瓶一遍，放置超净台中。
2.2 去妇产科取当天新鲜脐带。
2.3 将取出的脐带放在盛有含双抗PBS的玻璃培养皿中，洗净脐带表面的残留血液，将脐带两端各剪去一部分；更换一个新的玻璃培养皿，辨别脐带静脉(粗大的那根)，顺着静脉插入大针头，注入含双抗PBS，充分冲洗脐静脉，至流出液体中无可见血液；再更换一个培养皿，加少许PBS，把脐带放在培养皿中，从针头打入胶原酶(37℃预温)，当胶原酶从另一头流出少许的时候，用止血钳夹闭，继续注入胶原酶使脐带充盈后也封闭，37℃消化15 min(室温30℃ 20 min)。消化结束后收集所有消化液，吸取PBS冲洗脐带，合并到消化液中，1000 rpm离心5 min，弃上清，加入4 ml 培养液悬浮细胞，接种到明胶包被的塑料培养瓶中，12-24 h后换液一次。一般一根脐带消化下来的细胞可以培养一个培养瓶，如果细胞少就六孔板一个孔，细胞不能太稀疏，否则生长缓慢。
2.4 3-4天长满后用胰酶(含EDTA)消化以1:2传代时。实验中使用2-5代细胞。
3 结果
正常的内皮细胞呈典型的鹅卵石形状，如下图：
鉴定方法：可以采用CD31或vWF进行鉴定。如vWF鉴定，处理消毒好的盖玻片放置在一次性培养皿中，包被明胶后，将消化后的细胞接种在平皿中，待盖玻片上有大量细胞生长后，取出盖玻片，用冷丙酮固定，然后才用常规免疫组织化学方法鉴定vWF。
4 讨论
注意事项如下：
4.1如果培养瓶内有较多残余的血细胞，第二天予换液后即可，并不影响内皮的生长；
4.2 一定要确保有足够数量的内膜消化下来，否则细胞生长缓慢影响质量(如离心后，管底的白膜-消化下来的内膜较少，必要时可两段脐带合为一瓶)。
4.3 脐带来源母体的健康状况、脐带取材的时间、胶原酶消化的时间、培养液配方所给予的生长条件以及后续的一些消化传代换液的操作都将影响内皮细胞的生长和传代的次数。
参考文献
Marin V, Kaplanski G, Gres S, et al.Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. J Immunol Methods,2001,254(1-2):183-90.
