哺乳动物心脏由多种类型的细胞组成，近75%的细胞是非心肌细胞，诸如成纤维细胞和血红细胞。心肌的细胞亦即心脏细胞占有心脏组织细胞的其余25%。心脏细胞的增殖在胚胎发育的早期就开始了，然而大鼠出生前不久，心脏细胞的胞质分裂，有丝分裂和DNA合成几乎完全停止，出生后大鼠心脏质量的增大并非由于心脏细胞数变多，而是由于细胞个体体积扩张而致。尽管心脏细胞所占细胞总数比例少，但从体积角度来看，他们那是最大的。正因为该特点，许多研究人员已利用心脏细胞研究心肌的肥大现象和肥大的激素因素。
像其它哺乳动物纹状肌一样，心脏的收缩活动受制于一系列复杂的，组装成厚薄交错纤维的收缩蛋白。当心脏细胞于体外培养时，仍能维持原有的许多细胞结构和功能。例如，当用加血清培养基培养胚胎或新生鼠的心脏细胞时，它们能自发收缩，这为研究心脏的各种分子机制提供了一个极佳的体外模型。利用这种同步自发收缩的特性，培养的心脏细胞被用于探索与细胞收缩有关的因素以及细胞肥大及收缩的影响。
尽管使用培养的心脏细胞有许多好处，仍然有一些因素限制了其应用。新生鼠心脏细胞不具备增殖能力，故不可能传代，只能利用原代培养物，然而心脏细胞培养物易受培养技术水平及处理条件的影响，例如，新生鼠心肌组织对酶消化处理极其敏感。消化过度或者使用了错误的酶均能导致心脏细胞丧失贴壁能力和/或收缩现象。
1 材料
1.1动物
出生后1-4天SD乳鼠15只。
1.2试剂
低糖DMEM(Hyclone)、胰酶(含EDTA，Hyclone，液体包装)、青链霉素(Hyclone)、碳酸氢钠液、新生牛血清(Hyclone)、谷氨酰胺、D-Hank's液。0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精。
培养液：培养液(DMEM，20%新生牛血清，100 U/ml青链霉素)。
1.3 手术器械和仪器
饭盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml烧杯、250 ml锥形瓶、15 ml和50 ml的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200目尼龙筛网和针式滤器。
2 方法
2.1将胰酶用D-Hank's液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2.2解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's液中。重复以上过程。取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
2.3用第二套手术器械进行下列操作。用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1 mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。打开磁力搅拌器电源，预先将水温调节到37℃)，调节转速至60 rpm左右，消化15 min(务必保证水浴温度恒定在37℃，并且消化时间不超过15 min)。
或者，如果采用的是水浴震荡器的话，不用加搅拌子，直接放在水浴震荡器中消化亦可，转速和消化时间相同。
2.4 从水浴中取出锥形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血红细胞和成纤维类细胞。
2.5 加入10 ml新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液几次，机械分散细胞(组织消化后会成为粘稠的胶体状)，注意不要过分吹打，否则会导致组织过度消化，37℃水浴搅拌再消化10-15 min；如果乳鼠数目少(比如5、6只的时候)，消化时间可以减少为5-10 min，否则很容易消化过度。
上述消化处理的同时，往一支50 ml的一次性无菌离心管中加入20 ml预冷的含10%血清的培养液，并放置冰台上。
消化处理之后，小心移出上清转至上述加有培养液的离心管中，第一次消化收集的分离出的细胞，第一次消化结束后；继续第二次消化，余下的组织块加入10 ml新胰酶继续消化。
2.6 重复2.5消化步骤，直至剩余少许组织块为止，一般消化4-5次可以消化绝大多数的组织块(不含弃去消化液的那次)。
2.7 第1、2次含细胞的消化液放在一根离心管中，过180目筛网后，一起离心；第3、4次含细胞的消化液放在一根离心管中，过180目筛网后，一起离心。最后，分别用8 ml含20%血清的培养液重悬两管细胞，接种到一个75 cm2的塑料培养瓶中，放置在培养箱中1.5小时后，取出，弃贴壁细胞(主要是成纤维细胞和内皮细胞)，将未贴壁的细胞悬液取出，台盼篮拒染法计数后，加入培养液调整细胞浓度为5-6x105个/ml，接种到目的培养器皿中。
2.8 一般不用加BrdU，如果培养时间长(作者以前加，后来不加了，发现成纤维细胞也极少)，可以加入0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纤维细胞增殖。加了BrdU，心肌细胞搏动的持续时间会更长[1]。
2.9 接种后24小时，用温的培养基或者平衡盐液轻轻冲洗培养的心肌细胞一次，以去处未贴壁的细胞(部分细胞会在24小时后贴，结果很多细胞重叠生长)，再更换培养液，即可。可以按照实验需要在培养48 h或72 h后施加处理因素。
3 结果
心肌细胞刚接种时形状为圆形或椭圆形，大约在24 h左右基本贴壁，此时细胞伸出伪足，伪足在镜下为纤维状条索，细胞胞体则呈现不规则形状，如多角形，部分细胞有聚集倾向，细胞搏动效果较好，DMEM培养基在初始培养时为深红色，两天后变为淡黄色，应该是营养成分下降的表现，也说明细胞生长状况良好。我们也参考了一些国外文献的培养方法加以补充[2]。
鉴定的最简单的办法就是搏动与否，注意：当搏动比较微弱的时候，在10倍物镜下可能看不到搏动，换成20或40倍的物镜可能能观察到。检验操作是否合格的最好的办法就是看心肌细胞的纯度和搏动能力。另外，心肌细胞表达肌动蛋白，可以作为鉴定，但不是唯一的特征性指标，因为平滑肌细胞也表达。
4 讨论
乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞，培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法，0.06%浓度的胰酶对细胞损害较小，但这个浓度消化所需时间较长。采取多次反复低浓度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁1.5h，充分去除成纤维类细胞，达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状，并且会增殖，不搏动，很好和心肌细胞鉴别[3]。
消化和吹打一定不要过度，是保证心肌细胞活力最重要的一个原则。而接种密度(一般不低于105/ml)，也将影响到心肌细胞的搏动及同步化搏动。
猫耳朵战友补充的经验：
1 消化这一步骤：参考文献后，我选用80 U/mL的Ⅱ型胶原酶和0.05%的胰酶的配方进行复合消化。这样在消化过程中，组织块很容易消化。否则由于心肌致密的组织结构，胰酶要消化不下8次才能完全将组织块完全消化。如果每次消化时间是15分钟的话，基本上3次消化就可以完全了。
2.尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1-2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4 h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。
参考文献
[1]D.L. 斯佩克特. 细胞实验指南[M]. 第一版. 北京. 科学出版社. 2001:79-82.
[2]Wang HX, Zhang WM, Sheng JZ, Wong TM. High carbachol increases the electrically induced [Ca2+]i transient in the single isolated ventricular myocyte of rats [J]. Eur J Pharmacol, 1997;319:91-9.
[3]Animal cell culture methods edited by Jennie P. Mather and David Barnes.--California: Academic Press,c1998.--xiv,368p.24cm:ISBN0124800408:CNY619.26.
