完全培养液: 90% 高糖DMEM (Gibco 12430); 10% FBS (Biochrom S0615)
冻存液: 90% 完全培养液; 10% DMSO (Sigma D2650)
取得小鼠胚胎:
1．性成熟雌小鼠与种雄鼠按2∶1 比例合笼。
2．每天早上观察雌小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5 d。
3．取怀孕12.5~15.5 d 的雌鼠, 断颈处死, 无菌条件下暴露子宫。
4．用眼科镊提起近子宫颈端, 分离子宫系膜, 剪断子宫角。
5．取出整个子宫, 置于有PBS (Invitrogen 14190)的平皿内。用PBS 洗涤3 次, 弃除表面残余血迹。
6．沿子宫系膜侧剪开子宫, 取出带有胎膜的胚胎, 置于另一盛有PBS 的平皿内, 充分洗涤, 弃除表面红细胞。
7．用眼科镊撕破胎膜, 取出胎鼠, 弃除胎膜。
8．去掉胚胎头部和内脏, 将躯干部分置于另一盛有PBS 的平皿内, 用PBS 洗涤两次, 充分弃除红细胞。
要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源的成纤维细胞。
取得小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF):
1．用无菌眼科剪将鼠胚躯干剪成1 mm3 以下的碎块, 吸置于离心管内。
2．加适量0.25% Trypsin-EDTA (Invitrogen, 25200), 将离心管置于培养箱中温育20 min。
3．取出离心管, 反复吹打20~30 次, 加足量培养液终止消化。
4．分装到T75 培养瓶中, 一般每1 个胚胎可以制成1~2 个T75 培养瓶的原代细胞。
5．置37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱培养。
6．第二天换液, 去掉含有胰蛋白酶(trypsin)和较多死细胞的培养液。
7．待细胞长3~7 d, 细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可1∶3~1∶6 传代, 此传代后的细胞记为第一代。
要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。
MEF的传代方法:
1．吸弃培养液上清液。
2．PBS 冲洗两次。
3．吸去PBS, 加0.25% Trypsin-EDTA 消化。
在显微镜下观察, 当少量细胞漂浮, 贴壁的细胞层出现裂隙时, 用移液管吹打冲洗瓶底5~6 次。
4．即刻加MEF 培养液终止消化。
5．细胞悬液转移到离心管中, 1 000 r/min, 5min 离心。吸弃上清液。
6．加足培养液, 吹打制成单细胞悬液, 分装到各T75 培养瓶中。完成传代。
7．原代细胞中还有少量组织块未被充分消化,在以后的每次传代过程中要尽量制成单细胞悬液, 组织块会逐渐消失。
要点: 每次传代尽量把成纤维细胞消化、吹打成单细胞悬液, 随着培养时间增长和传代次数的增加, 细胞增殖速度减慢, 3~5 代的成纤维细胞都可用作培养小鼠胚胎干细胞的饲养层。
丝裂霉素C (mitomycin C)处理MEF:
1．取新的培养瓶, 加0.1% Gelatin (SigmaG2500)溶液覆盖预处理30 min, 用前吸掉Gelatin溶液。
2．取需要处理的MEF 细胞, Mitomycin C(Sigma M0503)以10 μg/ml 工作浓度加在MEF 培养液里, 混匀。
3．置培养箱中作用3 h。
4．吸弃废液。
5 ．用PBS 洗5 遍。
6．加0.25% Trypsin-EDTA 消化。在显微镜下观察, 当少量细胞漂浮, 贴壁的细胞层出现裂隙时,用移液管吹打冲洗瓶底5~6 次。
7．即刻加适量MEF 完全培养液终止消化。
8．细胞悬液转移到离心管中, 离心1 000 r/min,5 min。吸弃上清液。
9．处理过的MEF细胞加适量培养液重悬计数,以3.0×104个/cm2 (MEF)密度均匀地铺在明胶(gelatin)处理过的培养瓶上。
10．置培养箱中静置过夜, 使其贴壁。
11．铺好的饲养层在1~7 d 内都可以较好地支持小鼠胚胎干细胞的生长并维持其全能性
要点: 注意丝裂霉素C 的有效期和使用方法。购买的粉剂丝裂霉素C, 用之前应以适量PBS彻底融解, 0.22 μm滤膜过滤除菌, 分装后存放于4 ℃。若发现分装的丝裂霉素C 溶液析出结晶或溶液由浅蓝色转变成紫红色时, 说明丝裂霉素C 已经失效, 不能再使用。
(中科院上海生命科学研究院生化细胞所干细胞技术平台 徐兰 刘敏英)
