大鼠成体心肌细胞(adult rat cardiomyocytes)的分离和培养

2010-02-23 16:22 · Betsy

 【摘要】 目的: 探索稳定的大鼠成体心肌细胞的分离和培养方法. 方法: 应用主动脉逆行生物酶(5 g/L胰蛋白酶及1 g/L胶原酶)灌流法分离大鼠成体心肌细胞,免疫荧光染色法鉴定分离的心肌细胞,比较有无血清培养对心肌细胞的影响. 结果: 心肌细胞的存活率为95%以上;存活细胞呈

【摘要】 目的: 探索稳定的大鼠成体心肌细胞的分离和培养方法. 方法: 应用主动脉逆行生物酶(5 g/L胰蛋白酶及1 g/L胶原酶)灌流法分离大鼠成体心肌细胞,免疫荧光染色法鉴定分离的心肌细胞,比较有无血清培养对心肌细胞的影响. 结果: 心肌细胞的存活率为95%以上;存活细胞呈杆状,形态完整,长宽比约为4~6∶1;无血清培养心肌细胞只能存活1 wk,形态不发生改变;而加血清培养心肌细胞可存活2 wk以上,但超微结构发生了改变,且不同血清浓度对成纤维细胞生长具有不同的作用. 结论: 主动脉逆行生物酶(胶原酶和蛋白酶)灌流法是比较理想的心肌细胞分离方法;血清对成体心肌细胞的培养起着重要作用.

  【关键词】 大鼠;心肌细胞;分离;培养

  0引言

  乳鼠心肌细胞的培养虽然已有40多年的历史,但是乳鼠心肌细胞与成体心肌细胞相比无论在结构上还是功能上都存在着极大的差异,利用乳鼠心肌细胞培养来研究心肌细胞电生理存在着很大的局限性,因此人们开始探索成体心肌细胞的分离培养[1,2]. 对于电生理实验而言,成体心肌细胞培养具有更多的优点:①分离心肌细胞过程中,酶解使得细胞受到了一定破坏,培养后可以修复心肌细胞损伤,包括被破坏的膜蛋白(如受体、离子通道等);②急性分离的心肌细胞不适于较长时间的研究,而培养的心肌细胞可克服这一缺点[1]. 我们成功分离培养了大鼠成体心肌细胞,并比较了有无血清对细胞生长和存活的影响.

  1材料和方法

  1.1材料

  雄性SD大鼠(西安交通大学医学院实验动物中心),体质量280 g. 低糖DMEM(Gibco公司),胎牛血清(四季青公司),胶原酶Ⅰ及蛋白酶ⅩⅣ(Sigma公司),BSA(华美生物工程公司),小鼠抗大鼠心肌 α�actin抗体(Neo Marker公司),山羊抗小鼠IgG1�TRITC抗体(Oxford Biotechnology公司),其余试剂均为国产分析纯. CO2恒温培养箱(Heraeus公司),IX�70型荧光倒置显微镜(Olympus公司).

  1.2方法

  无菌解剖大鼠心脏,丝线绑缚于Langendorff灌注架上,37℃连续灌注无钙台氏液(mmol/L,NaCl 140,KCl 5.4,MgCl2 1.8,>HEPES>10,Glucose 10;pH 7.35~7.40)60 mL,然后用消化酶液(胶原酶Ⅰ 20 mg,蛋白酶3 mg,BSA 20 mg)30 mL循环灌注12 min,再用含0.06 mol/L Ca2+的台氏液60 mL灌注. 剪下心脏,在含100 μmol/L Ca2+的KB液(mmol/L,KCl 25,KH2PO4 10,MgCl2 3,Glucose 10,EGTA 0.5,牛磺酸20,L�谷氨酸 70,HEPES>10;pH 7.35~7.40)中用眼科剪刀剪碎,37℃轻摇10 min,200 μm滤网过滤,将滤液900 r/min离心1 min. 弃上清,加入含500 μmol/L Ca2+的KB液900 r/min离心1 min. 再用含1 mmol/L Ca2+的KB液重复1次. 用差速贴壁分离法纯化并于血细胞计数板上计数. 利用抗心肌α�actin抗体免疫荧光染色法鉴定心肌细胞.> 取6孔培养板(预先用20 g/L明胶包被)1个,分为3组,即无血清组(DMEM)、低浓度血清组(DMEM+50 mL/L FBS)和高浓度血清组(DMEM+100 mL/L FBS),每组2孔,置37℃,50 mL/L CO2培养箱中孵育. 24 h后换液,以后每3 d换液1次. 细胞培养后每24 h观察心肌细胞的形态. 分别于1,3 d,1和2 wk应用形态学及台盼蓝染色法做心肌细胞存活测定. 将心肌细胞用台盼蓝染色后,每组选择5个高倍镜视野,镜下观察细胞形态并计总数,杆状未着色者为存活的心肌细胞,计算心肌细胞的存活率.

  统计学处理: 数据均经SPSS 11.5统计软件处理,组间存活率比较采用χ2检验,P&0.05为差异具有统计学意义.

  2结果

  2.1心肌细胞形态观察新鲜分离的心肌细胞呈杆状,具有清晰的横纹,长宽比为4~6∶1(Fig 1A),抗α�actin免疫荧光染色可见清晰的横纹结构(Fig 1B).

  无血清组培养1 d后心肌细胞静止贴在培养板底上,形态完整,呈杆状,可见死亡崩解的细胞碎片. 培养3 d后心肌细胞内混杂的少量红细胞已经死亡,未见成纤维细胞生长. 培养1 wk后心肌细胞形态同前,未见明显分化,但死亡崩解的细胞碎片较前增多(Fig 2A). 血清组培养1 d后心肌细胞由细长变为粗短,两端变圆钝,3 d后变为圆形,透明,并出现自发性收缩,频率40~100次/min不等(Fig 2B),但是高浓度血清组3 d后即可见成纤维细胞生长,1 wk后形成大片集落,铺满孔底,而低浓度血清组培养5 d后方可见散在成纤维细胞生长,且并不形成集落式生长. 2 wk时无血清组存活细胞很少,多为死亡崩解的碎片,而低浓度血清组细胞死亡数较前增加,成纤维细胞仍为散在生长,高浓度血清组主要为成纤维细胞大量生长而心肌细胞数较少.

  2.2心肌细胞存活率各组的心肌细胞存活率见Tab 1.表1不同培养组心肌细胞存活率(略)

  3讨论

  心肌细胞的分离包括组织块法和生物酶灌流法,前者主要用于乳鼠心肌细胞的分离,后者常用于成体心肌细胞的分离,一般包括4个步骤[3]:①正常钙浓度溶液是为了恢复心跳,排空心肌间和心腔内的残血;②无钙溶液是为了解除细胞间的横桥;③酶溶液(低钙)是为了溶解细胞外基质;④低钙溶液或保护液是为了清除组织中的消化酶,减少消化酶对心肌细胞的进一步破坏.

  我们同时应用胶原酶(0.7 g/L)及蛋白酶(0.1 g/L)主动脉逆行灌流消化12 min分离心肌细胞,存活率可达到95%以上,培养1 wk时存活良好. 胶原酶和蛋白酶合用不但提高了成活率,也缩短了分离时间,减少心肌细胞缺血时间,进一步促进心肌细胞的存活. 但应根据心脏的形态、色泽判断心肌组织的消化情况,并及时应用牛血清白蛋白来中和消化.

  成体心肌细胞的培养方法一般有2种,去分化法(加血清培养)和快速吸附法(无血清培养)[1,4,5]. 我们分别比较了这两种培养方法,发现使用去分化法培养的细胞,多在24 h后形态就开始发生变化,原有的柱状开始变粗、两端变圆钝,48 h后变为圆形,这与文献报道一致[1]. 但是添加不同浓度血清对成纤维细胞的生长具有明显区别,这3组间存活率在3 d,1和2 wk时有显著差异,而1 d时无差异. 无血清培养组存活率最低,高浓度血清(150 mL/L)培养组存活率最高,但是低浓度血清(50 mL/L)培养组时只见零散成纤维细胞生长,未形成集落,而高浓度(150 mL/L)时培养3~4 d即可见成纤维细胞生长,1 wk后形成大片集落,呈成纤维细胞优势生长,最后逐渐覆盖培养板底部. 无血清培养1 d后心肌细胞静止贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,可见死亡崩解的细胞碎片. 培养3 d后心肌细胞内混杂的少量红细胞已经死亡,未见成纤维细胞生长. 培养1 wk后心肌细胞形态同前,仍呈杆状,未见明显分化,但死亡崩解的细胞碎片较前大量增加. 比较而言,低浓度血清(50 mL/L)培养既有较高的心肌细胞存活率,又不会形成大量的成纤维细胞生长,是一种较好的成体心肌细胞培养方法.

  心肌细胞不易贴壁,但是通过适当处理培养瓶壁可促进其贴壁,比如预先用明胶、Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白等包被培养板[1]. 新鲜消化离心后的细胞悬液中包含多种细胞成分,但主要为心肌细胞和成纤维细胞,由于成纤维细胞分泌胶原较多,故静置1 h后首先贴壁,而心肌细胞贴壁较慢,故可把两者分离开来,此即差速贴壁离心法. 培养24 h后存活的心肌细胞即可贴壁生长,而破坏严重的心肌细胞难于贴壁而悬浮于培养液中并逐渐肿胀、破裂而死,此时换液后可进一步获得高存活率的心肌细胞.

 

 

Isolation and culture of adult rat cardiomyocytes

  WANG Ting�Zhong, XI Yu�Tao, WU Ge�Ru, MA Ai�Qun

  Department of Cardiovascular Medicine, Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases, Ministry of Education, First Hospital, Xi�an Jiaotong University, Xi�an 710061 China

 

 

 

【Abstract】 AIM: To establish a method of isolation and culture of adult rat cardiomyocytes. METHODS: Adult rat cardiomyocytes were isolated by aorta retrograde collagenase perfusion and> identified with immunofluorence of α�actin, desmin and cTnT. The effects of culture with or without serum on adult rat cardiomyocytes were compared. RESULTS:> Homogeneous populations of 95% rod�shaped cells were obtained routinely and the cells were complete in shape and the ratio between the length and width was 4 or 6 to 1. Adult rat cardiomyocytes were alive in serum�free culture for only less than 1 weeks and no shape changes were observed. Myocytes in culture with serum were alive for more than 2 weeks but some ultrastructural changes were observed. Serum of different concentrations were found to have different effects on cultured cardiomyocytes. CONCLUSION:> Aorta retrograde collagenase perfusion is an ideal method to isolate cardiomyocytes. Serum has some important effect on adult rat cardiomyocytes culture.

  【Keywords】 rat; cardiomyocytes; isolation; culture

  【参考文献】

  [1] Mitcheson JS, Hancox JC, Levi AJ. Cultured adult cardiac myocytes: Future applications, culture methods, morphological and electrophysiological properties [J]. Cardiovasc Res, 1998; 39(2):280-300.

  [2] 许秀芳,李温斌,陈宝田,等.成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察[J].首都医科大学学报, 2000;21:104-107.

  Xu XF, Li WB, Chen BT, et al. Morphology study and isolated and cultured method of adult myocytes[J]. J Capital Univ Med Sci, 2000; 21:104-107.

  [3] Tytgat J. How to isolate cardiac myocytes[J]. Cardiovasc Res, 1994; 28(2):280-283.

  [4] Guinamard R, Rahmati M, Lenfant J, et al. Characterization of a Ca2+�activated nonselective cation channel during dedifferentiation of cultured rat ventricular cardiomyocytes[J]. J Membr Biol, 2002;8(2):127-135.

  [5] Valiunas V, Doronin S, Valiuniene L, et al. Human mesenchymal stem cells make cardiac connexins and form functional gap junctions[J]. J Physiol, 2004;555(Pt 3):617-626.

  作者简介:王亭忠(1977�),男(汉族),陕西省神木县人. 硕士生(导师马爱群),住院医师. Tel.(029)85274729Email.wangtz9603@sohu.com

  (西安交通大学第一医院心血管内科,教育部环境与疾病相关基因重点实验室,陕西 西安 710061)

 

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