【摘要】 目的: 探索稳定的大鼠成体心肌细胞的分离和培养方法. 方法: 应用主动脉逆行生物酶(5 g/L胰蛋白酶及1 g/L胶原酶)灌流法分离大鼠成体心肌细胞,免疫荧光染色法鉴定分离的心肌细胞,比较有无血清培养对心肌细胞的影响. 结果: 心肌细胞的存活率为95%以上;存活细胞呈杆状,形态完整,长宽比约为4~6∶1;无血清培养心肌细胞只能存活1 wk,形态不发生改变;而加血清培养心肌细胞可存活2 wk以上,但超微结构发生了改变,且不同血清浓度对成纤维细胞生长具有不同的作用. 结论: 主动脉逆行生物酶(胶原酶和蛋白酶)灌流法是比较理想的心肌细胞分离方法;血清对成体心肌细胞的培养起着重要作用.
无血清组培养1 d后心肌细胞静止贴在培养板底上,形态完整,呈杆状,可见死亡崩解的细胞碎片. 培养3 d后心肌细胞内混杂的少量红细胞已经死亡,未见成纤维细胞生长. 培养1 wk后心肌细胞形态同前,未见明显分化,但死亡崩解的细胞碎片较前增多(Fig 2A). 血清组培养1 d后心肌细胞由细长变为粗短,两端变圆钝,3 d后变为圆形,透明,并出现自发性收缩,频率40~100次/min不等(Fig 2B),但是高浓度血清组3 d后即可见成纤维细胞生长,1 wk后形成大片集落,铺满孔底,而低浓度血清组培养5 d后方可见散在成纤维细胞生长,且并不形成集落式生长. 2 wk时无血清组存活细胞很少,多为死亡崩解的碎片,而低浓度血清组细胞死亡数较前增加,成纤维细胞仍为散在生长,高浓度血清组主要为成纤维细胞大量生长而心肌细胞数较少.
2.2心肌细胞存活率各组的心肌细胞存活率见Tab 1.表1不同培养组心肌细胞存活率(略)
3讨论
心肌细胞的分离包括组织块法和生物酶灌流法,前者主要用于乳鼠心肌细胞的分离,后者常用于成体心肌细胞的分离,一般包括4个步骤[3]:①正常钙浓度溶液是为了恢复心跳,排空心肌间和心腔内的残血;②无钙溶液是为了解除细胞间的横桥;③酶溶液(低钙)是为了溶解细胞外基质;④低钙溶液或保护液是为了清除组织中的消化酶,减少消化酶对心肌细胞的进一步破坏.
我们同时应用胶原酶(0.7 g/L)及蛋白酶(0.1 g/L)主动脉逆行灌流消化12 min分离心肌细胞,存活率可达到95%以上,培养1 wk时存活良好. 胶原酶和蛋白酶合用不但提高了成活率,也缩短了分离时间,减少心肌细胞缺血时间,进一步促进心肌细胞的存活. 但应根据心脏的形态、色泽判断心肌组织的消化情况,并及时应用牛血清白蛋白来中和消化.
成体心肌细胞的培养方法一般有2种,去分化法(加血清培养)和快速吸附法(无血清培养)[1,4,5]. 我们分别比较了这两种培养方法,发现使用去分化法培养的细胞,多在24 h后形态就开始发生变化,原有的柱状开始变粗、两端变圆钝,48 h后变为圆形,这与文献报道一致[1]. 但是添加不同浓度血清对成纤维细胞的生长具有明显区别,这3组间存活率在3 d,1和2 wk时有显著差异,而1 d时无差异. 无血清培养组存活率最低,高浓度血清(150 mL/L)培养组存活率最高,但是低浓度血清(50 mL/L)培养组时只见零散成纤维细胞生长,未形成集落,而高浓度(150 mL/L)时培养3~4 d即可见成纤维细胞生长,1 wk后形成大片集落,呈成纤维细胞优势生长,最后逐渐覆盖培养板底部. 无血清培养1 d后心肌细胞静止贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,可见死亡崩解的细胞碎片. 培养3 d后心肌细胞内混杂的少量红细胞已经死亡,未见成纤维细胞生长. 培养1 wk后心肌细胞形态同前,仍呈杆状,未见明显分化,但死亡崩解的细胞碎片较前大量增加. 比较而言,低浓度血清(50 mL/L)培养既有较高的心肌细胞存活率,又不会形成大量的成纤维细胞生长,是一种较好的成体心肌细胞培养方法.
心肌细胞不易贴壁,但是通过适当处理培养瓶壁可促进其贴壁,比如预先用明胶、Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白等包被培养板[1]. 新鲜消化离心后的细胞悬液中包含多种细胞成分,但主要为心肌细胞和成纤维细胞,由于成纤维细胞分泌胶原较多,故静置1 h后首先贴壁,而心肌细胞贴壁较慢,故可把两者分离开来,此即差速贴壁离心法. 培养24 h后存活的心肌细胞即可贴壁生长,而破坏严重的心肌细胞难于贴壁而悬浮于培养液中并逐渐肿胀、破裂而死,此时换液后可进一步获得高存活率的心肌细胞.
【Abstract】 AIM: To establish a method of isolation and culture of adult rat cardiomyocytes. METHODS: Adult rat cardiomyocytes were isolated by aorta retrograde collagenase perfusion and> identified with immunofluorence of α�actin, desmin and cTnT. The effects of culture with or without serum on adult rat cardiomyocytes were compared. RESULTS:> Homogeneous populations of 95% rod�shaped cells were obtained routinely and the cells were complete in shape and the ratio between the length and width was 4 or 6 to 1. Adult rat cardiomyocytes were alive in serum�free culture for only less than 1 weeks and no shape changes were observed. Myocytes in culture with serum were alive for more than 2 weeks but some ultrastructural changes were observed. Serum of different concentrations were found to have different effects on cultured cardiomyocytes. CONCLUSION:> Aorta retrograde collagenase perfusion is an ideal method to isolate cardiomyocytes. Serum has some important effect on adult rat cardiomyocytes culture.