段慧琴1，张永东2，穆 祥1*
(1.北京农学院动科系，北京 102206；2.北京农业职业学院，北京 102442)
摘 要：微血管内皮细胞在许多病理生理过程中起着关键性的作用。应用体外培养的微血管内皮细胞，不仅广泛应用于微循环系统对不同生理或病理刺激的反应，也可阐明伴随微血管功能障碍和组织损伤的某些疾病的病理机制，所以分离培养动物及人各个器官组织微血管内皮细胞的报道日渐增多。微血管内皮细胞分离方法主要有3种，包括酶消化法、机械分离法和磁珠分离法，每种方法各有利弊。微血管内皮细胞一般通过其表面的血管紧张素酶、摄取乙酰基低密度脂蛋白和表达Ⅷ因子相关抗原进行鉴定。目前从不同组织器官分离培养微血管内皮细胞的方法已经比较成熟。
关键词：微血管内皮细胞；体外；分离培养
从1973年Jaffe E A等成功培养人的脐静脉内皮细胞至今，血管内皮细胞的研究已经取得了重要的进展，极大地丰富了人们对血管内皮细胞的认识。研究资料已经证实，动脉起源的内皮细胞不同于静脉起源的内皮细胞，微血管内皮细胞不同于大血管的内皮细胞[1]，并且不同器官组织起源的血管内皮细胞也表现出不同的功能特性。微血管内皮细胞所表现的组织器官特异性，使人们认识到微血管内皮细胞研究的重要性。因此，研究发生于某一器官或组织的微血管病变，应该采用这一器官或组织的微血管内皮细胞作为细胞模型。因此，微血管内皮细胞的培养技术越来越受到人们的重视，已经成为医学研究中不可缺少的重要手段。但是，由于微血管内皮细胞的培养难度较大，研究成本较高，因而它的普及和应用都受到一定的限制。近年来，内皮细胞生长因子的应用和免疫磁珠技术的发展，使微血管内皮细胞的培养和纯化变得相对简化，加之许多微血管内皮细胞系的建立，使得微血管内皮细胞的研究及应用得到迅速发展。
1 微血管内皮细胞体外培养状况
到目前为止，人体主要器官和组织的微血管内皮细胞已经培养成功。主要是骨骼肌[2]、心[3-4]、脑[5]、胃[6-8]、视网膜[9]、肺[10]、皮肤[11]、脉络膜[12]和小肠[13]微血管内皮细胞的培养，培养成功的还有脂肪、肝窦、肾、关节滑膜、胎盘、骨髓、胰岛、角膜及食道等器官组织的微血管内皮细胞。这些不同器官和组织微血管内皮细胞的研究，对于认识和了解组织器官内皮细胞的功能特性及对相关疾病的研究提供了有力的工具。
国内关于动物源性微血管内皮细胞的培养研究主要集中在大鼠的小肠[14]、肺脏[15]、脑[16]、兔脑[17]和牛视网膜[18]等器官组织。
2 微血管内皮细胞分离培养纯化方法
2.1 分离方法
微血管内皮细胞的分离是将剪碎的组织浸泡在消化酶中，因酶的消化一般是由外向里，所以最后被消化下来的细胞才是内皮细胞。因此，彻底地消化组织是获得足够微血管内皮细胞的前提，且非血管内皮细胞的污染是不可避免的。为了能分离获得足够的微血管内皮细胞，采用过量的酶消化是必要的。一般情况下，应用2 g/L的Ⅰ型或Ⅱ型胶原酶消化20 min～30 min。在某些情况下，需要再采用1 g/L胰蛋白酶/0.1%EDTA溶液进行二次消化，但总消化的时间应控制在30 min以内，以减少微血管内皮细胞的损伤。消化后的组织悬液需要用血清终止酶活性，并将组织悬液通过200目的金属筛去除未消化组织。
目前分离内皮细胞的方法主要有3种，即酶消化法、机械分离法和磁珠分离法。几种不同的分离内皮细胞的方法均有优势和局限性，常用的是酶消化法。其优点是分离的细胞多，纯度较高，缺点是酶对某些表面蛋白有破坏作用；后两种方法可以避免酶对内皮细胞的损伤，缺点是其他细胞的污染可能性较大。磁珠分离法是利用特异的介质(表面有内皮细胞特异单克隆抗体的磁珠)从其他细胞群中分离出内皮细胞。这种方法虽然可以分离出可用于炎症研究的微血管内皮细胞，但是分离的细胞量少。机械法一般用于大血管内皮细胞的分离，这种方法避免了酶对内皮细胞的损伤和其他细胞的污染。
2.2 细胞的纯化
由于在微血管内皮细胞的分离过程中必然伴随非血管内皮细胞的污染，因此微血管内皮细胞的纯化是决定微血管内皮细胞培养成功与否的关键，也是微血管内皮细胞培养的技术难度所在。目前已经建立了多种微血管内皮细胞纯化的方法，并在不同器官和组织微血管内皮细胞的培养中获得成功。在一种微血管内皮细胞的纯化中，往往会在细胞培养的不同阶段，根据细胞的特性、细胞的生长状态和污染的细胞类型采用不同的纯化方法。例如，肠黏膜微血管内皮细胞的培养需要采用局部消化和差速黏附的分离手段得到纯度较高的内皮细胞。在内皮细胞达到局部汇合时应用酶消化纯化血管内皮细胞。一般说来，这些纯化方法各有利弊，在一种细胞的分离中如何选择纯化的方法主要取决于操作者的经验。
目前，微血管内皮细胞纯化的方法主要有利用尼龙网或不锈钢网筛过滤细胞悬液、物理刮除法、生长特性选择法、局部消化法、差速黏附法和免疫磁珠法等，可以根据不同细胞的培养特性或生物特性选择其中几种方法进行纯化。
生长特性选择法是根据内皮细胞的生长特性加以分离，即已贴壁的组织块，培养一段时间后除血细胞外，其他细胞尚未离开组织块而微血管内皮细胞最先游出，这时立即移去组织块，所留的大部分是血细胞和内皮细胞，血细胞经传代1代至2代后自动消除，剩下便是微血管内皮细胞。这种方法由于避免了对细胞的机械和化学损伤，且不需特殊设备，操作简单，较为可取。
局部消化法是当不同类型的细胞群之间界限明显时，可在目的细胞区域滴加少量的消化酶，作用一段时间后，将消化液连同细胞吸出，再离心除去消化酶或终止消化后，将细胞接种于另外的培养板孔中进行培养。这种方法同物理刮除法一样，要求目的细胞的相对数量要大，并且与其他细胞界限相对明显。
差速黏附法，即根据不同细胞在生长表面黏附强度和对消化酶耐受性的不同，将目的细胞和污染细胞分开。因为内皮细胞较成纤维细胞贴壁牢固，用2.5 g/L的胰酶消化细胞，在倒置显微镜下监视，当成纤维细胞收缩变圆脱壁时，立即用含胎牛血清的培养基终止消化，随后轻轻吸去细胞液，大多数内皮细胞仍然保留在原培养板孔中。经过数次同样的处理，成纤维细胞基本可以被除去。
2.3 内皮细胞的鉴定
到目前为止，还没有发现不同器官组织的微血管内皮细胞具有共同的特异蛋白或标志。因此，微血管内皮细胞的鉴定大多是根据器官和组织的起源，从形态、表型、生化和功能等方面进行综合评价。微血管内皮细胞一般呈单层生长，有接触抑制现象，呈典型的铺路石状，电镜下可以看到Weibel-Palade小体。其表面可以表达CD31、CD34、凝血调节蛋白和第Ⅷ因子等，可以摄取低密度脂蛋白，产生前列腺素(PGI2和PGE2)，表达E-选择素，内吞功能，结合植物血凝素，形成毛细血管样网络[19]。
不管利用那种方法，培养的内皮细胞都可根据某些特征进行鉴定。内皮细胞可以利用其表面表达血管紧张素合成酶、摄取乙酰化低密度脂蛋白及第Ⅷ因子的表达进行鉴定。这些特性并不是内皮细胞特有的，间皮细胞也可以摄取乙酰化低密度脂蛋白。内皮细胞在培养条件下可以形成管形，像原始血管形成或损伤后血管再生，这被认为是内皮细胞独有的特征。但有报道说培养的上皮也可以形成管形。因此，一般情况下研究者们采用最有利的方法获得高纯度的内皮细胞，并用多种方法进行鉴定。
2.4 微血管内皮细胞的培养要点
根据微血管内皮细胞的生长特性，需要采用一些特殊的培养条件，并且这些培养条件可能因为微血管内皮细胞的起源不同而有所差异。微血管内皮细胞的培养一般选用DMEM、M199等基础培养基，pH 7.2，添加150 mL/L～200 mL/L的胎牛血清、1 000单位/mL双抗，20 g/L谷氨酰氨，还需添加内皮细胞生长因子(一般添加浓度为1%)。根据其接触抑制现象需及时进行传代培养。
3 肠黏膜微血管内皮细胞的体外分离培养
体外培养的内皮细胞的分离、生长以及研究已有数十年了，已具备从不同种属不同器官系统分离内皮细胞成熟的技术和方法。关于肠黏膜微血管内皮细胞的体外培养，在国内尚未见报道。国外已成功的分离和培养了正常和病理情况下人肠微血管内皮细胞[13]。
索占伟等[14]选用24 h内的SD大鼠乳鼠空肠作为细胞来源，是因为乳鼠的肠黏膜微血管更为丰富，且分离的组织块易贴壁，增殖分化能力强。尽管从胃肠道分离微血管内皮细胞技术难度较大，但是可以通过体外模型来直接分析比较正常和病理状态下血管内皮细胞的功能。试验采用组织块贴壁法成功培养出原代大鼠肠黏膜微血管内皮细胞，再通过局部消化和差速黏附的分离手段得到纯度较高的内皮细胞。他们认为，该方法是一种简单、经济、重复性好的肠黏膜微血管内皮细胞的培养方法。得到的肠黏膜微血管内皮细胞生物特性相对稳定，并可传15代以上。
4 展望
微血管内皮细胞主要定位于进行血液-组织交换的微血管，因此广泛地涉及各种疾病的发病机制。其中与微血管内皮细胞关系密切的疾病包括以下5类：①炎症与感染；②免疫与自家免疫；③心血管疾病；④肿瘤的生长与转移；⑤移植排斥反应。
应用体外培养的微血管内皮细胞，可以构建各种实验模型来研究生理和病理情况下微血管内皮细胞的基因、表型和功能，以及与各种组织细胞相互作用及其调控机制。微血管内皮细胞在医学方面的研究具有广泛的应用价值，如构建血管内皮细胞屏障模型，研究药物的转运和细胞迁移，通过缺氧-再氧化研究血管内皮细胞缺血-再灌注损伤，构建血管发生模型研究肿瘤的生长和抗血管发生药物等方面将发挥重要作用。
