摘要 为了建立兔角膜内皮(RCE)细胞系, 以家兔角膜为实验材料对RCE细胞的体外培养及其细胞系的建立进行了研究. 取活家兔角膜, 采用内皮面朝下进行贴板培养, 并利用时间梯度连续揭膜法筛选出仅含有纯净RCE 细胞的培养孔, 收集纯一的RCE 细胞悬浮于含有硫酸软骨素氧化降解物、牛眼生素、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、家兔角膜基质细胞培养液、羧甲基壳多糖、N-乙酰葡萄糖盐酸盐和氨基葡萄糖盐酸盐的DMEM/F12 培养液(20%胎牛血清) 中, 置CO2 培养箱中启动原代培养. 启动培养的RCE 细胞呈四角形或多角形, 3 周后即可长成单层. 在随后的继代培养中, RCE 细胞的形状逐渐由多角形变为成纤维样. RCE 细胞生长状态稳定, 现已被传至67 代, 已经建成了一个新的连续性RCE 细胞系. 经鉴定, 该细胞系细胞的群体倍增时间约为53.8 h; 第67 代培养细胞的特征性染色体数目为44 条, 但出现了染色体的非整倍性. 综合特征性染色体数目、抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体的免疫细胞化学染色、血管内皮生长因子(VEGF165)实验和形态回复实验的研究结果, 证明该细胞系确为家兔角膜内皮细胞系, 为哺乳动物角膜内皮细胞的理论研究及人造角膜内皮的研制奠定了基础.
关键词 角膜内皮细胞 细胞系 染色体数目 神经元特异性烯醇化酶 血管内皮生长因子 家兔
哺乳动物角膜内皮由单层六角形内皮细胞镶嵌而成, 这层细胞在成年后失去了分裂能力, 局部细胞损伤后只能依靠邻近细胞扩张和移行来填补缺损区[1]. 一旦角膜内皮细胞密度低于维持内皮细胞生理功能的临界密度, 角膜将出现不可逆之病变而致盲[2,3]. 这类角膜病是一种常见的致盲眼病, 其患者绝大多数可以通过角膜移植而复明. 但遗憾的是, 由于角膜移植材料的高度匮乏, 在我国等待做角膜移植的120 万病人中, 只有3000~4000 人能接受角膜移植手术, 绝大多数患者因得不到捐献角膜而无法重见光明[4]. 近年来角膜组织工程的兴起, 为人造眼角膜带来了新的希望, 但如何在体外获得大量的角膜内皮细胞以及如何研制出一种可降解的生物相容性好的角膜内皮支架材料, 一直是该领域的研究热点和主攻方向[5].
对哺乳动物角膜内皮细胞的体外培养研究开始于1960 年. 1965 年, Slick等人[6]利用酶消化法首次获得纯的家兔角膜内皮细胞(rabbit corneal endothelial cells, RCE细胞)并成功启动了其体外培养. 随后, 学者们先后对兔、小鼠、大鼠、牛、猪、猫和人角膜内皮细胞的体外培养进行了研究[7~11].
后来, 学者们又对不同哺乳动物角膜内皮细胞的体外培养条件进行了摸索, 发现一些生长因子及角膜间质细胞分泌物对角膜内皮细胞具有一定的促分裂作用[12~15]. 1993 年, Wilson等人[16]首次用猿猴红疱疹病毒(SV40)大T抗原对人角膜内皮细胞进行了转染, 获得了可继代培养的角膜内皮细胞. 后来, 许多学者也纷纷利用SV40, 淋巴瘤病毒, SV40 大T抗原和不同癌基因等对人、兔和小鼠的角膜内皮细胞 进行了转染实验, 虽然获得了几个可传代细胞系, 但由于具有致瘤性而无法用于人工角膜的构建和临床角膜移植手术[17~22]. 到目前为止, 仍没有不利用转染技术而成功建立哺乳动物角膜内皮细胞系的报道.
近年来越来越多的证据显示, 角膜内皮来源于神经外胚层, 而不是中胚层[23,24]. 神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)已可被用作鉴定人眼中神经嵴来源细胞的分子标记[25,26]. 1998 年, Böhnke等人[26]在长期培养的人角膜内皮中鉴定到了特异性的NSE阳性反应, 得出了可以用NSE鉴定长期培养角膜内皮细胞的结论, 从而为人们鉴定长期培养的内皮细胞提供了一个较为理想的方法.
1980 年, Folkman等人[27]发现培养在肿瘤条件培养液中的血管内皮细胞具有自然形成毛细血管样网络的属性. 大量的研究表明, 血管内皮生长因子 (VEGF)及其受体是血管形态发生的主要调控因子, 此VEGF体系则在内皮细胞分化、迁移、增殖、血管形成及血管组装具有重要作用[28,29]. 2002 年, Chen等人[30]用VEGF对培养在重组细胞基底膜上的人脐静脉内皮细胞进行了处理, 发现这些内皮细胞也能形成典型的毛细血管样网络. Watanabe等人[31]则明确指出, 毛细血管样网络的形成是血管等内皮细胞的特有功能, 且VEGF在体外能够促进培养在不同凝胶基质上的血管内皮细胞形成毛细血管样网络. 因此, 在 VEGF作用下能否形成毛细血管样网络已经成为鉴定内皮细胞的形态学标志之一.
本文以家兔眼角膜为材料, 对RCE 细胞进行了体外培养和建系研究, 旨在建立RCE 细胞系, 为哺乳类角膜内皮细胞系的建立和人造角膜内皮的研制奠定基础.
