一、实验目的
1、系统了解淋巴细胞杂交瘤实验技术的全部过程；
2、学会观察与判别融合细胞的出现，并计算融合率。
二、实验原理：
小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在HAT选择培养基中可以选择得到杂交细胞。这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某B淋巴细胞产物——单克隆抗体。
三、实验材料：
免疫的BALB/小鼠，SP2/O骨髓瘤细胞株，CO2培养箱 超净工作台 倒置显微镜 光学显微镜 恒温水箱 计数板、计数器、盖玻片； 离心机 手提式自封消毒锅 弯头滴管 吸量管（1.0、0、5.0毫升） 注射器（5毫升，10毫升） 针头（7#） 细胞培养瓶 24孔、96孔培养板（天津产或进口） 酒精灯 120目钢丝网 ￠9cm平皿 50ml带盖塑料离心及管 100毫升三角瓶、青毒素小瓶 烧杯（100，500，1000毫升） 微滤器1000毫升正压不锈钢滤器 微孔滤膜 眼科剪、镊 脱脂棉、纱布、胶布、卫生卷纸
HAT培养基 HT培养基 无血清培养基 15%小牛血清培养基 小牛血清 乙醇（AR，工业纯） C—PBS
四、培养基与试剂的配制：
1、RPMI-1640培养基的配制；
RPMI-1640粉 10.4g
丙酮酸钠 0.11g
Hepes 5.925g
三蒸水 1000ml
磁力搅拦器搅拦3小时，溶解后过滤除菌，在4℃中保存。
2、200mML-谷氨酰胺的配制：
L-谷氨酰胺 1.461g
三蒸水 100ml
深解后，过滤除菌，分装小瓶，每瓶1ml，在-20℃保存。
4.5%碳酸氢钠（NaHCO3）配制
NaHCO3 5g
三蒸水 100ml
8磅高压灭菌15分钟，在4℃保存。如分装小瓶，每瓶4.2ml。5、次黄嘌呤及胞腺嘧啶核苷（HT）100倍母液配制：
次黄嘌呤（Hypoxanthine，H）10—2m
68.05mg
胞腺嘧啶核苷（Thymidine,T）16×10-3m
19.4mg
三蒸水 50ml
在45—50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管中，每管1—5ml，在-20℃保存。
6、氨基碟呤（A）4×10-5m
1.76mg
三蒸水 90ml
IN氢氧化钠 0.5ml
溶解后，加入IN盐酸0.5ml中和，补充蒸馏水至100ml
过滤除菌，分装小试管内，每管1—5ml，在-20℃保存。
7、无血清RPMI-1640 100ml
L-谷氨酰胺200nM（0.2） 1.0ml
抗菌素（青、链霉素各1万单位） 1.0ml
5%碳酸氢钠 4.2ml
8、RPMI-1640完全培养基配制
RPMI-1640完全培养液 100ml
L-谷氨酰胺200mM（0.2m） 1.0ml
青、链霉素（各1万单位/ml） 1.0ml
5%碳酸钠 4.2ml
小牛血清（灭活） 15ml
9、HAT培养基的配制：
RPMI-1640完全培养基 100ml
100倍HT母液 1.0ml
100倍A母液 0.8ml
10、HT培养基的配制
RPMI-1640完全培养基 100ml
100倍HT母液 1.0ml
11、50%（W/V）聚乙二醇（PEG）液的配制
PEG 10.0g
8磅15分钟，或煮沸20分钟灭菌并且融化，冷至50℃时加入。
RPMI-1640无血清培养基 10ml
混合均匀，分装小试管内，每管0.7ml，在-4℃中保存。
12、0.15MPH7.2枸橼酸钠-PBS配制：
NaCI 6.4g
KCI 0.16g
NaHPO4·H2O 2.32g
KH2PO4 0.16g
枸橼酸钠 7.6g
二蒸水 1000ml
分装在100ml瓶中，每瓶50—100ml，8磅15分钟高压灭菌后，在4℃保存。
13、20%二甲基亚矾（DMSO）细胞保存液的配制（按体积计算）：
小胎牛血清 5份
RPMI完全培养基 3份
二甲基亚矾（DMAO） 2份
混匀，在4℃保存，不必过滤除菌或高压清毒二甲亚矾，因它也是有毒的以至于自身是无菌的。
14、8-氮鸟嘌呤100倍母液的配制
8-氮鸟嘌呤 1 152mg
0.36%NaHCO2 1.0ml
4N NaOH 100ml
三蒸水 100ml
过滤除菌，分装小瓶，每瓶1.0ml，在-40℃保存。
15、0.1%伊文氏兰液配制：
伊文氏兰液（Fveng’s blue） 0.1g
0.15M PH7.2枸楷酸钠-PBS 100ml
混匀，4℃保存，也可配制成1%溶液，保存，使用前再稀释成0.1%。
五、实验步骤：
1、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与1-5×107SO2/O小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；
2、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；
3、将37℃水浴中保温的50%PEG1.0毫升（实际应用0.7毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37℃水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；
4、加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置90秒钟，立即在2—4分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基（37℃），开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。注意尽可能不搅动细胞；
5、再经100转/分离心10分钟。弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升；
6、将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37℃孵育。CO2含量为5%；
7、每2—3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。2周后使用HT培养基。
六、注意事项：
1、细胞杂交瘤的实验全过程必须是在严格的无菌条件下进行，任何一个环节的疏忽均可导致严重污染。因而须严格的无菌操作。
2、试剂价格相对昂贵，应注意节省。
3、试验中的各个环节，尤其是结细胞融合过程和细胞克隆的筛选工作更为重视。
