一、目的：
掌握冻存和复苏细胞的技术
杂交瘤细胞株一经建立应尽快冻存，以保证杂交瘤细胞不至于因传代污染或因变异而丢失，在克隆化前将抗体阳性的样本冻存，在一旦克隆传代失败或在增殖过程中丢失，还可将保存的杂交瘤细胞重新复苏，继续进行实验。将细胞冻存还可避免繁重的细胞传代工作量以及不明原因的污染和细胞在培养过程中的变异。
用于细胞融合的骨髓细胞株也可同样方法保存：以取得稳定可靠的亲本细胞来源。因此，冷冻保存细胞株是杂交瘤研究的一项重要的实验技术。
该技术同样适用于一般动物细胞的冷冻和保存。
二、原理：
主要是城保护下，降低保存温度甚至用深低温（—196）保存，借以减低或几乎停止细胞的活力的能量产生机构，从而延长保存期。
冷冻保护剂有许多种类，而较普遍采用的是二甲基亚矾（Demathy,Sulfoxide,DMSO）它的作用既能降低细胞的新陈代谢，又能维护细胞膜的强度，使水分不易进入细胞而影响其冷冻保存。
三、试剂、器材：
1640完全培养基，10%D COLOR: black; LINE-HEIGHT: 150%;"<完全培养基，无血清1640培养基。
恒温水浴、液氮罐、玻璃安瓶或带密封盖的塑料小管，装安瓶的小布袋，刻度离心管，胶塞、培养或小培养瓶、小烧杯、细胞计数用器材。
四、操作方法：
1、细胞悬液配制：取生长旺盛、形态良好的待冻存细胞，用离心法收集细胞，并用冻存培养基将细胞调至3-5×106/ml。
2、分装：将细胞悬液注入2ml安瓶中或塑冷冻管中，每支0.5—1.0ml，封紧（安瓶用火焰封口），每只安瓶上标上细胞名称、冻存日期、装入小布袋中。
3、缓慢降温，原则上要使冻存细胞瓶的温度每分钟下降1℃，待降至-60℃-70℃时，再将细胞浸没有液氮中，各实验室的操作方法根据细胞的种类和经验略有不同，以下两法均可使用。
①将细胞管先放置4℃或普通冰箱冰格内2小时，再移至液氮容器面上，停留30分钟后（约-60℃-70℃），再浸入液氮中。
②将细胞瓶放入壁厚1—2cm的聚乙烯泡沫塑料盒中（自制），密封后，放在—80℃冰箱中过夜，次日将细胞瓶移至液氮中。
亦有人将安瓶放在4℃冰箱中4小时，再置安瓶于气态氮中20分钟，然后立即放入液态氮中。
五、细胞复苏：
1、从液氮罐中取出安瓶或其它类型塑料冷冻管，有时冷冻管因未封严，浸入液氮后，取出后安瓶或管子内液迅速气化可以爆炸（力量有限）因此应戴手套和防护眼镜。
2、迅速放入装有37℃-40℃的热水烧杯中（放在超净工作台内），用镊子夹紧并不时摇动，令尽快融化。
3、如用安瓶冷存，取出后，用70℃酒精擦试消毒后。折断颈部，如用塑料管，则防止融融时渗入水，打开盖子，用吸管吸出悬液，注入离心管中，再补加10毫升培养液（滴加）；或直接滴入装有10ml培养液中（可以用无血清培养液）。
4、低速离心（1000转/分）5-7分钟，去上清，一般不再重复用培养液洗一次。
5、用培养液适当稀释后，装入培养瓶中或24孔培养板中37℃5%CO2培养箱内培养，次日更换一次培养液后，继续培养。
6、以后仍按常规传代培养进行培养。
注意事项：
1、安瓶或管内冻存的细胞数量要充分，在融解后能允许做1：10-1：20的稀释，最后细胞数量/毫升仍要比一般高一些，一般再培养接种浓度为5×104/毫升，因此冻存细胞密度应达到107毫升，在融后稀释20倍后，仍能保持5×105/毫升数量。
2、加入一定量的饲养细胞有助于复苏细胞成活，饲养细胞的密度一般105/毫升左右。
3、一般复苏细胞的成活率在20—70%左右。
参考资料：
①章谷生等主编：单克隆抗体医学上的应用 上海科学技术出版社 1987.4
②柏乃庆编著 人体保存（细胞、组织和器官的保存技术） 上海科学技术出版社 1985.3
③张和君等编译 单在隆抗体及细胞免疫实验技术 云南科学技术出版社 1986.12
④刘祖洞等编 遗传学实验（第二版）高教出版社 1987.11
