自第一株人类胚胎干细胞(hESCs)系面世以来, hESCs 在人类疾病治疗等多领域的潜在应用一直在吸引越来越多的科学家投入到这项研究中。在国际干细胞领域, hESCs的培养方案已经初步规范化并且随着hESCs 的自我更新和分化调控机制上新发现的不断涌现, 细胞维持方案也在随之发展和改进。本期专题我们将向读者介绍一种可以较好地维持 hESCs 正常遗传特性、全能性和自我更新能力的 hESCs 维持方案。
1 培养试剂
饲养层细胞完全培养液: 90% 高糖DMEM (Gibco 12430); 10% FBS (Biochrom S0615)。
hESCs 完全培养液: 80% DMEM/F12 (Gibco 11330); 20% 血清替代物(Gibco 10828); 2 mmol/L L-glutamine (Gibco 25030); 2 mmol/L 非必需氨基酸 (Gibco 11140); 0.1 mmol/L β-巯基乙醇(Gibco 21985- 023); 4 ng/ml bFGF 溶液(Gibco 13256-029)。 bFGF储存液:
保持无菌, 分装后−20 ℃保存。
基质胶溶液(用以铺饲养层细胞前处理培养容器底面):
溶解基质胶前1天, 将产品放在4 ℃过夜使其溶化, 用冰冷的DMEM/F12 稀释分装, −20 ℃保存。
胶原酶溶液:
将胶原酶溶于DMEM/F12培养基中, 用0.22 μm过滤器过滤除菌。分装后保存于−20℃, 避免反复冻融。
2 制备饲养层
https://shiyan.ebioe.com/embryonicstemcell.htm向大家介绍了制备饲养层的方法和培养hESCs 时制备饲养层的注意点, 在此不再赘述。
3 解冻hESCs
(1) 解冻前1 h, 将已经用基质胶处理过并且已经铺好饲养层细胞的6孔板吸掉MEF培养液, 用PBS 洗两遍后, 添加已经温育好的hESCs培养液1 ml/孔。
(2) 把hESCs冻存管从液氮罐中取出, 两手来回搓冻存管10~15 s, 直到冻存管外的霜除去。
(3) 将冻存管浸入37 ℃水浴, 轻轻摇动。注意: 不要浸没盖子。
(4) 用酒精棉球擦拭整个冻存管, 并在超净台中风干。
(5) 在15 ml 离心管中加入5 ml 已经温育过的 hESCs 完全培养液, 用1 ml 微量加样器轻柔地将冻存管内的细胞吸起, 转移至上述15 ml 离心管中, 解冻的过程尽量快速、温和地进行。
(6) 轻轻混匀两次, 尽量不要吹散细胞团块。静置离心管5 min, 使细胞团块在重力作用下下沉。
(7) 吸掉上清液。
(8) 重新加入5 ml hESCs 完全培养液, 重复步骤6 ∼ 7 。
(9) 加适量培养液重悬细胞团, 并将细胞团均匀地加到6 孔板中的每个孔内, 1 ml/ 孔。
(10) 小心地将6 孔板放入培养箱, 避免震动。 (11) 48 h 后换新鲜的培养液, 之后每24 h 换液。
(12) hESCs 克隆复苏存活率很低, 每次复苏约 1 周后可在显微镜下观察到小克隆, 复苏后2 周传代。之后, 每隔5~7 天传代。
4 hESCs 传代
(1) 至少提前一天准备好饲养层细胞, 传代前1h, 将已经用基质胶处理过, 并且铺好饲养层细胞的6孔板吸掉MEF 培养液, 用PBS 洗两遍后, 添加已经温育好的hESCs 培养液1 ml, 放回培养箱。
(2) 把待传代的细胞吸掉培养液, 加入足量的Ⅳ型胶原酶溶液(6 孔板, 1 ml/ 孔)。
(3) 将6孔板置培养箱温育10 min, 可见hESCs 克隆逐渐从边缘卷起, 直到整个克隆从孔板底面上脱落。
(4) 用1 ml 微量加样器将脱落的克隆转移至一个15 ml 离心管。
(5) 加适量hESCs 完全培养液, 轻轻混匀。
(6) 将离心管静置5 min, 使克隆块在重力作用下下沉。
(7) 吸掉上清液, 重复步骤5~6。
(8) 吸掉上清液, 加适量的完全培养液, 轻轻吹打6~7 个来回。
(9) 将细胞悬液加入已经铺好的饲养层细胞上面, 将培养板上下左右水平地晃动, 使hESCs 小克隆块均匀地分布在饲养层上面。
(10) 放入培养箱, 并且小心开关培养箱的门, 避免造成震动。
(11) 48 h 后换液, 以后每24 h 换液。
5 冻存hESCs
(1) 配制2× 冻存液, 即80% hESCs 完全培养液+20%二甲基亚砜(DMSO), 混匀后置冰上预冷, 当天用当天配。
(2) 状态良好的hESCs克隆用胶原酶温育, 步骤如hESCs 传代第2~8 步骤。
(3) 将预冷好的2× 冻存液逐滴加入, 一边加一边晃动离心管。
(4) 用加样器轻轻混匀克隆块悬液, 分装到冻存管, 写上标签。
(5) 将冻存管放入程序降温盒, 置−80 ℃; 从滴加冻存液到放入−80 ℃冰箱的过程同样要求操作者动作迅速且温和。
(6) 第二天, 将hESCs 冻存管转入液氮永久保存。
