完全培养基: 高糖DMEM (GIBCO 12430); 15% 胎牛血清(BIOCHROM S0615); 0.1 mmol/L非必需氨基酸(GIBCO 11140-050); 2 mmol/L谷氨酰胺(GIBCO 25030); 0.1 mmol/L β-巯基乙醇(GIBCO 21985); 1 000 U/ml白血病抑制因子(CHEMICON ESG1107)
冻存液: 90%胎牛血清或完全培养液; 10%二甲基亚砜(DMSO, Sigma D2650)
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一 小鼠胚胎干细胞复苏
1. 操作前把培养液在37 ℃水浴中温热。
2. 从液氮中取出一支冻存管的小鼠胚胎干细胞, 放入37 ℃水浴中晃动, 直到只剩下小冰晶。
3. 吸取冻存管内的细胞悬液加至有少量完全培养液的15 ml 离心管中, 1 000 r/min 离心5 min。
4. 吸弃上清液, 加4~6 ml 培养液, 吹打悬浮。 5. 重复吹打, 制成单细胞悬液, 尽量避免气泡。
6. 转移到1个已经铺好饲养层的25 cm2培养瓶中培养。
7. 每天换液。
要点: 复苏过程中“速融”是关键。由于在常温下DMSO 对细胞有毒性, 应尽量缩短复苏的时间。离心去掉DMSO。
二 小鼠胚胎干细胞传代
1. 一般在复苏后第2~3 天传代, 视克隆的大小和密度而定。
2. 吸弃废液。
3. 用PBS (不含钙镁)轻轻冲洗两遍。
4. 加0.5 ~1.0 ml 的胰蛋白酶(0.25%)-EDTA (0.02%)溶液至培养瓶, 左右晃动, 使胰酶覆盖整个瓶底, 消化细胞。
5. 在显微镜下观察, 直到细胞层全部脱落(一般需要1~2 min)。
6. 加适量(4~5 ml)完全培养液终止消化。
7. 多次轻轻吹打细胞, 制成单细胞悬液。
8. 细胞悬液转移到15 ml离心管, 1 000 r/min离心5 min。
9. 吸弃上清液, 加足量的培养液, 吹打混匀, 细胞悬液分装到各铺好饲养层的25 cm2 培养瓶中, 一个培养瓶加5~6 ml ES 培养液。
10. 放入培养箱中。
11. 每天换液。要点: 传代比例1∶4~1∶10, 即长满一个培养瓶的细胞可以传代至4~10 个同样大小的培养瓶中。细胞离心后重悬液必须吹打成单细胞悬液。
三 小鼠胚胎干细胞冻存
1. 按传代的方法把细胞消化下来, 制成细胞悬液。
2. 1 000 r/min 离心5 min。
3. 弃上清液, 逐滴加已经预冷的冻存液并不断摇动混匀。
4. 分装到冻存管中, 标记。
5. 将冻存管置程序降温盒, −80 ℃过夜, 转入液氮。
要点: 冻存液的配方是90% 完全培养液和10% 的DMSO, 如果细胞株比较珍贵需要提高复苏存活率的话可以增加冻存液中血清的比值, 甚至可以用血清代替完全培养液。由于在常温下DMSO对细胞有毒性, 应将配好的冻存液在冰上预冷。快速分装到各个冻存管以后马上置程序降温盒, −80 ℃过夜。
