1981 年Martin［1］等首次分离培养了小鼠的胚胎干细胞（embyonic stem cell）后，胚胎干细胞已成为当今生物医学最热门和最为前沿的研究课题之一，而饲养层细胞对于胚胎干细胞的增殖和维持未分化状态具有重要的作用。目前，多熟研究采用小鼠成纤维细胞作为饲养层，也有用人胚胎成纤维细胞做饲养层［2］。用传统的方法制备饲养层，耗时较长，成纤维维细胞的质与量不稳定，为此，对原方法进行了改良，力求在较短时间内，培养出优质高产的小鼠成纤维细胞。
1 材料和方法
1.1 培养液和消化液用DMEM 的培养液（Gibco 公司），补加NaHCO3 2 g / L 及HEPES 2 g / L，过滤除菌。在- 20℃以下保存备用，用前加15%新生牛血清（NBS，杭州四季清公司）、青霉素100 IU/ ml、链霉素100 μg / ml。消化液为 0.25%胰蛋白酶（Sigma 公司）。
1.2 试验动物年龄为7 ～ 8 周的性成熟昆明鼠（由中山大学中山医学院实验动物中心提供）。雌、雄按2 : 1（雌: 雄）合笼。每天早上观察雌鼠阴道。有乳白色或蛋黄色冻胶状物（阴道栓），可确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕 0.5 d。
1.3 成纤维细胞分离培养方法
常规方法1：细胞悬液法，按照参考文献［2］进行，断头处死孕12.5 ～ 14.5 d 的雌鼠，取鼠胚，去头、内脏和四肢，留躯干。剪成1 mm 以下的碎块，加1 ml 消化液，吹打30 s，室温下3 ～ 5 min，吸取上层液体，再加入胰酶，重复上述操作5 ～ 6 次，最后弃组织块，将收集的上层液离心，弃上清液，加入培养液，吹打均匀后分别放到培养瓶内培养。
常规方法2：组织块培养法，按参考文献［3］进行。用 PBS 冲洗剪碎的组织块3 次后，把组织块以相互距离的0.5 cm 放入培养瓶内，翻转培养瓶，使瓶底向上，在培养箱静置2 ～ 4 h 后，加适当培养液，3 d 换液一次，每天观察。
改良方法：胰酶消化植块培养法。此法与组织块培养法基本相同，区别之处仅在组织块放入培养瓶之前用胰酶轻度消化组织块，5 ～ 8 个鼠胚，用0.25%胰酶10 滴，作用 30 s；9 ～ 14 个鼠胚，用15 滴0.25%胰酶，作用30 s 后加入等体积的有完全培养液终止消化。
2 结果
2.1 细胞悬液法第2 天可见成纤维细胞生长，细胞量虽多，但死亡的细胞也较多，细胞活力减弱，4 ～ 5 d 后可传代。
2.2 组织块培养法第2 天可见少量成纤维细胞，细胞生长缓慢，需要7 ～ 8 d 才能传代。
2.3 胰酶消化后组织块培养法胎龄12.5 ～ 14.5 d 的小鼠胚胎用胰酶消化植块培养后，第2 天可观察到成纤维细胞从组织块边缘爬出。成纤维细胞呈长梭形，胞浆饱满，细胞生长迅速，3 ～ 4 d 长满培养瓶，可传代，传代后弃组织块（或重新贴瓶壁培养），第2 代可见到较均一的成纤维细胞。以后2 ～ 3 d 传代1 次，连续传代3 ～ 5 代，杂细胞已完全去除，此时获得较纯的细胞，细胞生长旺盛，状态好，可以作为饲养层使用。将2 ～ 3 代细胞放入液氮冻存，2 ～ 3 个月后解冻，复苏细胞，细胞仍可以继续生长，并能保持旺盛状态。
3 讨论
用优质的小鼠成纤维细胞作饲养层是胚胎干细胞分离培养和传代的关键技术之一，而传统的方法耗时较长，且质量不稳定，我们的胰酶消化植块培养法操作简单，易掌握，仅在组织块放入培养瓶之前用胰酶轻度消化，松解组织细胞间的连接，使成纤维细胞易于长出；该法所得的成纤维细胞由于生长旺盛，细胞量多，传代快，在较短时间内可获得优质的饲养层。
参考文献
1. Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teracarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA，1981，78：7634 ～ 7638.
2. 薛庆善主编. 体外培养的原理与技术，北京：科学出版社，2001，516 ～ 517.
3. 司徒镇强，吴军正主编. 细胞培养，西安：世界图书出版公司，1996. 86 ～ 87.
