细胞培养是将器官、组织或细胞从生物机体中取出，模拟该器官、组织或细胞在机体内的生理条件，在体外进行培养，使其能够继续生存、生长和繁殖。一些研究结果表明，许多种类的动物或植物的细胞都能在人工培养条件下生存、生长和繁殖。
现代的动物细胞培养始于美国动物学R.G.Harrison。他于1906年在无菌条件下，以淋巴液做培养基，培养了蝌蚪的神经板，并观察到神经细胞突起生长的过程。到了20世纪后半叶，随着分子生物学和细胞生物学的崛起，为了在活细胞中研究生命现象，细胞培养方法得到了广泛的发展和应用。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响。因为人工培养条件易于改变，并能得到严格的控制，有利于单因子分析。二是细胞培养便于我们对细胞生长、发育过程的观察，可以用显微镜直接观察亦可应用显微缩时电影技术记录其进程。因而，细胞培养是探索和解释细胞生命活动规律的一种简而易行的技术。
然而，细胞培养方法也有其局限性，由于培养的细胞生活在脱离了机体的复杂的环境条件下，其生态环境和细胞之间的相互关系都改变了，因此，其细胞生物学性质必然也会发生某些改变。所以在人工培养条件下观察到的结果难于正确反映细胞或组织在机体内部的状况。这一点是我们在应用此技术进行研究时应该注意的。
尽管如此，由于细胞培养技术的优点是其他实验方法和技术所不能比拟的，所以近年来，细胞培养技术在分子生物学、遗传学、老年学、免疫学、肿瘤学和病毒学等很多领域都得到了广泛的应用，并取得了很多重大的成果。
细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。
一、目的与要求
通过本实验了解原代细胞与传代细胞培养的基本方法以及在细胞培养过程中严格的操作程序。
初步掌握无菌操作的基本原则，认识无菌操作在细胞培养中的重要性。
二、实验内容
1、原代细胞的制作——示范
2、传代细胞的传代
三、实验步骤
（一）原代细胞的制作——以乳鼠肾细胞原代单层静置培养为例，按实验时操作的顺序进行描述。
1.操作者首先进行手的清洗与消毒，再将实验用品放在合适的位置，然后配置营养液及调节平衡盐液的pH值。
2. 配液
（1）乳鼠肾细胞营养液的配置：
0．5％LH 液 90％
犊牛血清 10%
1万单位/ml青、链霉素 加至约100单位/ml
7.4%NaHCO3 调pH至6.8~7.0
(2)平衡盐液－Hank液的调节：
用7.4％NaHCO3调Hank液的pH至6.8~7.0
(3) 调胰蛋白酶的pH值
25%胰蛋白酶溶液中加入数滴NaHCO3,充分混匀,使其pH值为6.8~7.0。
3 .处死动物
在动物细胞培养中，为避免过多血细胞的干扰，一般采用剪断动物颈动脉放血的方法处死动物，然后用水浸湿体表的被毛（或用新洁尔灭溶液）。将动物固定在解剖板上，使其背部向上，先用碘酒棉球消毒背部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。
4.取肾
在腰部的后缘，用解剖剪提起皮肤，剪开皮肤，将剪开的皮肤分别拉向两边。此时，再换一把解剖剪及解剖镊，剪开背部的肌肉，暴露出腹腔，即可见到肾脏（一般右肾略低于左肾），用弯头眼科镊取出肾脏，置于无菌培养皿中。
5.剪肾
用眼科剪及镊，将肾膜剪破，并将其剥向肾门，去肾膜及脂肪。再用Hank液洗涤一次，再将洗过的肾脏转入另一培养皿中。另换一把眼科剪及镊，沿肾脏的纵轴剪开，去掉肾盂部分，将肾剪成数块，然后用Hank液洗涤一次。将洗过的肾块转移入无菌的青霉素瓶（或小烧杯）中。用弯头眼科剪，将肾剪成1立方毫米大小的块，组织块的大小应尽量均匀一致，再用Hank液洗涤2～3次，直到液体澄清为止。
6.消化及分散组织块
将上步清洗过的Hank液吸掉，按组织块体积的5～6倍量加入0.25%胰蛋白酶液(pH为7.6~7.8)。置于37℃水浴中进行消化。消化时间在20～40分钟左右（消化时间的长短与多种因素有关，如蛋白酶的活性及浓度，不同动物及年龄，组织块的大小等等）。每隔10分钟摇动一次青霉素瓶，以便组织块散开，以利于继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。这时可从水浴中取出青霉素瓶，吸去胰蛋白酶液，再用 Hank洗涤2～3次。然后，加入少量乳汉液，用吸管反复吹打组织块，直到大部组织块均匀分散成混淆的细胞悬液为止。此时，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布（或不锈钢网）进行过滤，以除去部分较大的组织碎片。
7.计数与释稀
从上步滤过的细胞悬液中吸取1ml细胞液，进行计数。将细胞滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释，稀释后的浓度一般为每ml含细胞30～50万为宜。
8.分装与培养
将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中（一般5ml/小方瓶，1ml/青霉素瓶），盖紧瓶塞，注意瓶塞一定要紧。在培养瓶的上面做好标记，以免培养瓶放反，并在瓶口处注明细胞，组别及日期。然后放于培养架上，并轻轻摇动培养架，避免细胞堆积，以便细胞能均匀分布。最后将培养瓶置于37℃条件下进行培养。
9.观察
置于37℃培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：
（1）培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示已经被污染。
（2）细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液 pH过高。
（3）培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。
经过1～2天的培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。换液时也要注意无菌操作，在酒精灯旁，倒去原培养液，再加入等体积的新配营养液，pH7.0。若经2～3天后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。如果希望细胞长得更好些，此时也可换液，换液时，所用的营养液称为维持液，它与营养液的组成完全相同，仅所用血清为 5％。以后，每隔3～4天（视细胞液pH值而定）更换一次维持液。待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养。
（二）传代细胞的传代
在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成致密单层，即可进行细胞的传代培养。
各种传代细胞的传代方法基本相同，只是各种细胞所需的营养液成分有差别，现以HeLa传代细胞系为例介绍细胞传代的基本方法。
1.首先配制营养液
E－EM液 90％
犊牛血清 10％
双抗（1万单位/ml） 约100单位/ml
3%谷氨酰氨 1ml
7.4%NaHCO3 调 pH至7.0~7.2
2.在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液，然后加入适量的无钙，镁离子的PBS液，轻轻摇动，将溶液倒出。
3.消化与分装
在上述瓶中加入适量消化液（0.02%EDTA或0.04%EDTA+0.5%胰蛋白酶液各一半）以盖满细胞为宜，置于室温，停留2～3分钟，翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙（针孔大小的空隙），如出现缝隙，即可倒去消化液，如未出现缝隙，则可将瓶翻回，继续进行消化，直到出现缝隙为止（消化时间的长短与不同的细胞及生长状态有关）。此时，可倒去消化液，加入新配置的营养液3ml，以中止消化。然后用吸管吸取培养瓶中的营养液，反复吹打瓶壁上的细胞层，直到瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时，可继续轻轻吹打细胞悬液，以使细胞散开。随之即可补加营养液，细胞传代的比例，不同的细胞亦不同，HeLa细胞一般以1:2或1:4进行分装，即一瓶细胞可分装两瓶。若原瓶为5ml营养液，要分装成两瓶，则需补液到10ml，混匀，即可将另一半分装至另一瓶中。
4. 培养
分装好的细胞瓶上，做好标志，注明细胞代号、日期。置于细胞架上，轻轻摇动。以使细胞均匀分布，以免细胞堆积成团。然后置于37℃培养。
5.观察
（1）观察体外培养细胞的几个问题：
细胞培养24 小时后，即可进行观察，观察的重点如下
A.首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度。
B. 观察培养液颜色变化及细胞是否生长。
C.如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时，可参照以下（2）的描述进行。
D.观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死活细胞的比例。
（2）细胞的生长阶段及形态特征
传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。一般单层培养的细胞，从培养开始，经过生殖、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将其分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：
A．游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩和表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数小时。
B．吸附期（贴壁）：由于细胞的附壁特性，细胞悬液静置培养一段时间（约7～8h）后，便附着在瓶壁上（此期不同细胞所需时间不同）。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。
C．繁殖期：培养12h以后直到72h（不太细胞亦不同），细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛（即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布瓶壁上），到细胞铺满整个瓶壁（即所谓形成细胞单层）的过程。此期细胞形态为多角形（呈现上皮样细胞的特征）。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以“＋”的多少表示如下：
细胞占瓶壁有效面积（也就是细胞能生长的瓶壁面积）的25％以内有新生细胞。一般要观察3－5个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。
细胞占瓶壁有效面积的25～75％以内具新生细胞。
细胞占瓶壁有效面积的75～95％具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。
细胞占瓶壁95％以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。
为细胞的对数增长期（或称为指数增长期），
D．维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。
E．衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙、细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。
四、思考
1.细胞传代培养的操作程序及注意事项。
2.细胞培养获得成功的关键要素是什么？
3.体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。
附录：细胞培养中的有关问题
（一）细胞的计数方法
细胞计数一般用血球计数板，按白血球计数法进行计数。
操作方法如下：
1.首先取待稀释的细胞悬液1ml加4ml生理盐水（或Hank液）作5倍稀释。
2.先将特制的盖玻片放在血球计数板上，使两侧均现带色牛顿环。用血色素吸管（或细胞管）取少量待测细胞悬液，沿盖玻片边缓缓滴入，让其自由渗入，待整个盖玻片下均充满细胞悬液为宜。注意不要使液体流到旁边的凹槽中（图2）
3.在显微镜下，用10´10的倍数进行计数，所用计数板如图2所示。
4.计数的方法：按图2计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个方格中，如果有细胞位于线上，一般计上线细胞不计下线细胞，计左线细胞不计右线细胞，计数误差不能超过±5％。
5.计数的换算：计完数后，需换算出每毫升悬液中的细胞数。由于计数板中的每体积即为0.0001cm2。故可按下式计算
原细胞悬液细胞数/ml＝n /4´10000´5（稀释倍数）
n＝四大格内的细胞总数
（二）影响离体细胞生长繁殖的一些因素
细胞生长、繁殖的最适条件是它们在机体内所处的条件，但如将组织、细胞从机体内取出，让其在离体条件下生存，那就必须模拟机体的环境。然而机体毕竟是太复杂了，所以在体外只能保证细胞生长，繁殖所需要的最基本因素，现简单介绍这些因素的作用。
1.培养基（液）：细胞培养所用的培养基主要是人工合成的。通常其主要成分含有氨基酸、维生素、糖类、无机盐、生长因子和其他的辅助物质。当然不同的组织和细胞对培养基成分的要求有所不同，因而进行培养时应区别对待，为其选择最适条件的配方。配制时应注意以下几点：
（1）水是细胞生命活动的重要因素之一，细胞培养用的各种液体都要用水配制。由于有毒物质和元素等即使含量很低也能引起细胞培养的失败，所以细胞中所用的水必须经过高度的纯化。通常使用的是三次蒸馏水或去离子水。
水质的好坏可用电导仪检测其电阻值，即水中离子的导电状况，越低的水含离子越少，电阻值也越高。一般以25°C时的欧姆（W）/cm表示。细胞培养用水的电阻值一般选用100万欧以上的去离子水为宜。
（2）无机离子既是维护细胞生命所需要的成分，而且对维持一定的渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度等方面都起着重要的作用。所以在配制细胞培养液时，必须根据这几方面的需要，加入必需的一些无机盐类。就多数动物来说，所需的无机盐类有Na＋，K＋，Ca2＋，Mg2＋，Cl－，碳酸盐，磷酸盐等。它们彼此之间常保持一定的比例。破坏了这种关系，就会使培养的细胞受到损害。
（3）血清是细胞培养液中的重要成分之一。血清中含有丰富的营养物质，如蛋白质和核酸等，血清不仅为细胞的生长提供所必需的营养，还具有促生长能力。血清对细胞附着和生长均有明显的促进作用，并能中和有毒物质的毒性，使细胞不受到损伤。用于细胞培养的血清来源是多种的，如人血清、马血清、兔血清等。最常用的是牛血清。一般讲动物愈年轻，其血清愈有利于细胞生长，故成年牛血清不如犊牛的好。细胞培养中所用血清的质量会直接影响到细胞生长的状况。
（4） pH值对细胞生长有影响。来源不同的细胞，由于它们处于有机体的不同部位或器官，其所处外环境的pH值也不相同，所以在培养细胞时，应参考该细胞在机体内所处外环境的pH值配置适宜pH培养基（液）。一般以中性为好，刚开始培养的哺乳动物的细胞，pH在7.0左右较好，贴壁生长的细胞在pH7.2－7.4生长最好，以不超过pH6.8－7.6为宜。高于或低于此限度时，往往会引起细胞死亡。在细胞培养过程中，必须注意培养液pH值改变与细胞生长的关系，找出规律。在pH值变得不适于细胞生长时，应及时更换新的营养液。
2.温度：离体培养细胞一般要参考该种动物的体温设计培养时所用温度。通常哺乳动物的体温在37－38.5°C，禽类略高些，温度在39°C－40°C。因此，离体哺乳动物细胞培养的温度最适为37－38.5°C。在较低温度环境中，对细胞影响不大，但细胞对较高温度却比较敏感。
3.密度：密度是指细胞接种浓度。在细胞培养中，接种的细胞数目对细胞的生长状况有很大的影响。适宜的细胞浓度可以促进细胞的增殖。接种的细胞浓度过大或过小，均对细胞的增殖不利。尤其是原代细胞，其接种量与培养时细胞增殖的关系最大。一般接种的细胞（如肾细胞）数目以30－70万/ml为宜。
4.器皿的清洗：细胞培养所使用的器皿必须干净，所以在细胞培养工作中，器械的清洗是十分重要的，也是起关键性作用的工作，它直接影响到细胞培养的成败。
（1）新玻璃器皿的清洗步骤：先用自来水或肥皂水刷洗干净，放入洗液中过夜或浸泡几天，取出用自来水冲洗8至10次。然后，用蒸馏水洗3 次，用去离子水（或三蒸馏水）洗2－3次，烤干、包装、灭菌。
（2）橡皮制品的清洗步骤：一般选用白皮橡皮塞，使用前先用自来水洗涮干净，以后用2％NaOH煮20分钟，用自来水冲洗5－6次，再用1.3％HCl煮30分钟，用自来水冲洗5－6次，用蒸馏水洗3次，最后用去离子水洗，干后包装灭菌。
（三）细胞培养的有关名词及其概念
1.原代培养（primary culture）
直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。这种培养称之为原代培养。
2.传代培养（subculture）
细胞从一个培养皿以1：2或1：2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养，这种培养称之为传代培养。
3.悬浮培养（suspension culture）
细胞培养的一种类型。培养时通过一特殊的装置，使细胞瓶按一定的速度不断地转动，使细胞始终处于悬浮状态中进行增殖。
4.克隆（clone）
克隆指的是从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（population）。
5.细胞系（cell line）
在第二届细胞和组织培养专题讨论会上提出细胞系的概念为“原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（lineages of cells）所组成。如果不断继续传代或传代数有限，可称为有限细胞系（finite cell line），如果可以连续传代，则可称为连续细胞系（continous cell line）。以前认为细胞系来自细胞发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限的传下去。这种细胞的特点是染色体为异倍体，丧失了正常细胞的“接触抑制”的特性。
6.细胞株（cell strain）
细胞株的概念如下：由原代培养中，用选择或克隆代，选出具有特征标记的细胞，经传代形成细胞株，这些特性或标记在以后的培养中必须保持下去。以前认为经体外传代培养后细胞不表现退化现象，大约可传50代以上者，其染色体维持二倍体不变，保留正常细胞的“接触抑制”等特性。
