实验原理】
直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养称为原代细胞培养。原代培养是建立各种细胞系的第一步，是从事培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。根据培养方法不同分为组织块培养法和单层细胞培养法。
【实验目的】
掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中的无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法。
【仪器、材料及试剂】
1．仪器：培养箱（调整至37℃）、培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）
2．材料：胎鼠或新生鼠
3．试剂：1640培养基（含10%小牛血清），0.25%胰蛋白酶，Hank’s液，碘酒，酒精。
【操作步骤】
1．胰酶消化法
①器材：将孕鼠或新生小鼠引颈处死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
②用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
③用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至离心管中。
④视组织块量加入5—10倍的0.25%胰酶液，37℃水浴中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，使细胞分离。
⑤待组织变得疏松，颜色略为发白时，加入3—5ml培养液（含10%小牛血清）以终止胰蛋白酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
⑥1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
⑦加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
⑧加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
⑨将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。
2．组织块直接培养法
自上述方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块，置37℃培养箱静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
【注意事项】
1．自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2．在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3．凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
4．操作前要洗手，进入超净工作台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
5．点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
6．操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
7．不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
8．瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
9．吸溶液的吸管等不能混用。
附Hank’s液配方：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，酚红0.02g，加H2O至 1000ml
注：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。
