混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte cultue，MLC)——3H-TdR掺入法
一、目的及要求
1、熟悉混合淋巴细胞培养的原理；
2、掌握分离淋巴细胞的方法；
3、学习用同位素标记进行混合淋巴细胞培养的操作方法。
二、实验原理
混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte cultue，MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR）是将二个无关个体的淋巴细胞混合在一起培养，由于二者的淋巴细胞膜上的组织相容性抗原不同，可互相刺激，导致对方的淋巴细胞分裂增殖和转化。转化的淋巴母细胞表现为细胞体积增大，核内DNA和胞浆内RNA合成增加等。可通过形态学方法计数转化的淋巴细胞百分数，也可通过测定激活的淋巴细胞摄取DNA合成的前体-3H标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入量的多少来判定。同位素标记法较为客观，重复性好且结果较准确。其增殖反应强度与双方组织相容性抗原的差异程度成正比。两者相容性愈差，反应愈强烈。
本法有双向和单向MLC之分，在双向MLC中，双方的淋巴细胞互相刺激而增生、转化，即双方的淋巴细胞既是刺激细胞，又是反应细胞；在单向MLC中，将一方的淋巴细胞用X线照射或用丝裂霉素C处理，使其丧失增殖反应能力而仍保留其抗原刺激效应，此时的MLC只有一方淋巴细胞发生增殖反应，故可了解不同个体淋巴细胞刺激强度与增殖反应强度。
三、器 材
（一）、材料和试剂
1、人外周血淋巴细胞：取两个不同个体A和B的肝素抗凝外周血，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。洗涤后用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×106/mL；
2、RPMI 1640培养液（100mL）：内含经56℃、30min灭活的小牛血清10mL、双抗（青、链霉素）lmL，用5.6%NaHCO3调pH至 7.2～7.4；
3、丝裂霉索C（mitomycin C）：用双蒸水配成400μg/mL溶液；
4、3H-TdR。用生理盐水稀释为500μg/mL，4℃存放；
5、闪烁液、生理盐水。
（二）、器 具
离心管、滴管、微量加样器、试管架、同位素微量加样器、同位素测量杯、49型玻璃纤维滤片、超净工作台、细胞培养板、CO2培养箱、离心机、细胞收集仪、β液闪烁计数仪等。
四、操作步骤
1、将A、B二个体的淋巴细胞悬液分别做记号，以个体A的作为MLC的反应细胞，个体B的作为MLC的刺激细胞，记作Bm；
2、刺激细胞处理：取个体B的淋巴细胞悬液0.9mL，加人400μg/mL的丝裂霉素C 0.1mL，使其终浓度为40μg/mL细胞悬液，置37℃水浴30min，离心弃上清，沉淀细胞用培养液洗一次，调整细胞浓度至1×106/mL；
3、用微量加样器各取0.1mL反应细胞（A）和刺激细胞（Bm）于一圆底细胞培养板的孔中（A+Bm），同时，设自身对照组AA或BBm和空白对照组。置37℃ 5%CO2培养箱内培养5d。
4、在培养终止前15～16h，用同位素微量加样器于每孔内加入3H-TdR 1μL（含0.5μCi）。空白对照组，此时不加同位素；
5、样品处理：用细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用生理盐水洗去游离的3H- TdR、将滤片置60℃烘箱中烤干，冷却后将滤片放入含闪烁液的测量杯中，用β体闪烁测量仪检测放射强度。空白对照在样品处理前加入同位素，处理方法同实验组；
6、实验结果计算：以每分钟脉冲数（counts per minute，cpm）表示。所有样品在数据处理前，均应减去空白对照组的cpm值。MLC反应强度通常以样品的cpm值或刺激指数（stimulation index，SI）表示；也可用cpm净值表示。
五、注意事项
1、刺激细胞与反应细胞的浓度，一般采用1:1或2:1；
2、培养时间一般为5～6d，3H-TdR掺人时间一般为终止培养前15～16h；
3、细胞培养板以圆底为好；
4、实验时应注意无菌操作；
5、本试验可用于组织器官移植配型、移植后急性排斥反应的监测指标和HLA、H-2Ⅱ类抗原的分型等研究；
6、用两个无血缘关系个体的淋巴细胞做试验，阳性反应明显；
7、所用器材，应按同位素操作的有关规定处理。
