一．原理
Northern 杂交是用来测量真核生物RNA的量和大小估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括：
1. 完整mRNA的分离
2. 根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离
3. 将RNA 转移到固相支持物上，在转移的过程中，要保持RNA 在凝胶中的相对分布
4. 将RNA固定到支持物上
5. 固相RNA与探针分子杂交
6. 除去非特异结合到固相支持物上的探针分子
7. 对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析
二．DNA 探针的制备与标记
1．材料
纯化的PCR产物
2．仪器
电泳仪，紫外分析仪， 离心管，移液枪，碎冰
易生物仪器库：https://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：https://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
3．试剂
10× transcription buffer；10× nucleotide mix (10mm each ATP GTP CTP)；20U RNase
inhibitor；40U T7，T3or SP6 RNA Polymerase；DMPC处理水；DNase I (40U) RNase free；
EDTA (0.2M PH 8.0)；RNA-free water (含40 U RNase inhibitor)
4． 方法
(1) 将10ng-3μg 纯化模板DNA，RNase-free 水加到灭菌RNase free 1.5ml 离心管中，终
体积为15 μl。
(2) 沸水浴10min后快速置于冰上。
(3) 依次加入下列试剂
(4) 短暂离心，温和混合，37℃保育1-20h。
*注意：过长时间保育不能增加标记RNA产量
*注意：仅在RNase保护试验中被要求。
(5) 加65℃温育10min或加入2μl 0.2M EDTA ( PH 8.0)终止反应。
(6) 琼脂糖凝胶电泳检测DNA探针长度。
(7) 探针分装保存在-20℃备用
*注意：避免探针反复冻融。
三．Northern杂交
1. RNA分离与转膜
1）材料
注：实验中所有的试剂的配置都要使用无RNase的水。
（1）10 × BPTE 电泳缓冲液
100mmol/L PIPES (piperazome-1, 4-bis (2-ethanesμlfonic acid)， 哌嗪-, N’ –双(2-乙磺酸)) ； 300mmol/L Bis-Tris (bis [2-hydroxyethyl] iminotris [hydroxymethy] methane) ；10mmol/EDTA (pH8.0)；10 × 缓冲液的最终pH 值约为6.5。10 × 缓冲液的配置:将3g PIPES(游离酸), 6g Bis-Tris (游离碱)，2ml 0.5 mol/L的EDTA (pH8. 0)加到90ml 双蒸馏水中，在37℃用终浓度为0.1%的DEPC处理1h，然后高压灭菌
（2）乙二醛
商业储存的乙二醛溶液(40%或6mol/L)含有各种水合形式的乙二醛,一些氧化产物，如乙二醛酸、蚁酸及一些能降解RNA的化合物，因此必须去除这些杂质。
（3）乙二醛反应混合物
6 ml DMSO，2 ml 去离子乙二醛，1.2 ml 10 × BPTE 电泳缓冲液，0.2 ml 溴乙锭 （10mg/ml 水溶液），分装成小份，贮存于-70℃。
2）方法
电泳分离RNA：
(1) 配置乙二醛变性反应液。在无菌离心管中混合：
RNA（总共 10 μg） 1 ~ 2 μl乙二醛反应混合液 10 μl每个电泳泳道中可分析10μg RNA。用Northern法可分析10μg 总细胞RNA 即可检测到其中的大量mRNA。要检测到稀有RNA则需要至少1.0μg poly（A）+ RNA。RNA相对分子质量标准参照物应当像待侧样品一样的乙二醛反应液中制备。
(2) 盖上离心管的盖子。将RNA 溶液在55℃放置60 min，在冰水中冰浴10 min，然后离心5s，使所有液体沉到离心管底部。
(3) 在样品加热过程中，将琼脂糖凝胶装到水平电泳仪的盒子中。加入足够的1×BPTE电泳缓冲液，使其没过凝胶约1 mmol/L。
(4) 将1 ~ 2 μl RNA 上样缓冲液加到乙二醛化的RNA 样品中，然后马上把RNA样品加到凝胶加样孔中，留着两边最外面的两个孔不要加样。将RNA 相对分子质量标准参照物加到最外面的孔中。
(5) 以5V/cm 的电压进行电泳，直到溴酚蓝迁移大约8 cm。
(6) 将凝胶放在保鲜膜上，在紫外灯下观察RNA。把透明尺和凝胶对齐，在紫外灯下拍照。
(7) 在照片上量出从加样孔到各RNA 条带的距离。以RNA 片断大小的对数（log10）值对迁移的距离作用。用得到的曲线计算点杂交检测到的RNA 的大小。
(8) 利用半干转印系统把RNA 固定在固体支持物上。
变性RNA的转移和固定：
(1) 将凝胶转移至培养皿中，用锋利的刀片修去凝胶的无用部分，在凝胶的左上角切取一角作为标记。
(2) 将凝胶置于0.5×TBE中平衡30min。
(3) 用切纸刀裁一张长宽均大于胶1mm 的尼龙膜，切去膜一角，使其与凝胶的切角对应。
(4) 将尼龙膜和6 张与胶大小一致的滤纸置于0.5×TBE中平衡10min。
(5) 将3 张滤纸平铺于电转移装置的金属箔片上（阳极），用玻棒赶走所有气泡。
(6) 将已平衡的尼龙膜平铺于滤纸上，用玻棒赶走所有气泡。
(7) 小心将凝胶置于尼龙莫上，并使两者的切角相重叠，确保胶与膜之间没有气泡。
(8) 将另外3 张滤纸置于胶上，用玻棒赶走所有气泡。
(9) 于最上层加入约15ml转移缓冲液（0.5×TBE）以湿润滤纸。
(10) 将支持框至于胶/膜/滤纸四周，接上阴极电极，盖上安全盖，接上电源供给装置（确保电极插 头连接正确），给予3mA/cm2 的恒流，转移时间一般为30-35min（电转过程中，电压保持在20V左右，若超过25V，则须终止转移）。
(11) 电转结束后，用2×SSC 漂洗尼龙莫。
(12) 将尼龙莫置于一张干的滤纸上，在波长254nm 处按照0.120J/cm2 的剂量照射3min。
2. 杂交
1）试剂
DIG Easy Hyb
2）方法
(6) 将变性的DIG 标记的DNA 探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2膜）。小心
混匀，避免产生泡沫。
(7) 开泵排走预杂交液。
(8) 关泵，等到负压消失，加入上述探针/杂交液，温育至少6h。
开泵排走DNA 样品溶液（注意：每次开泵应完全抽走薄膜上的试剂）。注：杂交温度因
不同探针而异。
3. 洗脱
(1) 用2×SSC，0.1% SDS于15-25℃洗脱2次，每次5min。
(2) 用0.5×SSC，0.1% SDS 于65-68℃洗脱2 次，每次15min。
4. 显色
1）材料
DIG-labeled 核苷酸
2）试剂
(1) Washing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; ph7.5 (20℃); 0.3% (v/v)Tween20
(2) Maleic acid buffer: 0.1 M Maleic acid, 0.15M NaCl; 用NaOH（固体）调节pH到7.5 (20℃)
(3) Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, ph9.5 (20℃)
(4) TE buffer: 10mM Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8.0
(5) Blocking stock solution: 用Maleic acid buffer 将Blocking reagent 稀释为10%（w/v）
(6) Blocking solution: 用Maleic acid buffer 将10× Blocking reagent 稀释为1×working solution
(7) Antibody solution:每次使用前将Anti-Digoxigenin-Ap, 10000rpm 离心5min, 用Blocking solution将Anti-Digoxigenin-AP 稀释5000倍
(8) Color substrate solution: 于10ml Detection buffer 贮藏液中加入200μlNBT/BCIP(避光保存)
3）方法：
(1) 把杂交仪温度调至25℃。
(2) 杂交后按严格的步骤洗脱后，用Washing buffer 简单的清洗。
(3) 于100ml Blocking buffer 中保育30min。
(4) 在20ml Antibody solution 中保育30 min。
(5) 用100ml washing buffer 洗2*15min。
(6) 在20ml Detection buffer 中平衡2-5min。
(7) 在黑暗的合适的容器中，将膜于10ml 新鲜配制的Color substrate solution 中保育0.5h-16h (该过程不要摇动，可一段时间的暴露灯光下观察染色情况)。
(8) 当所需的颜色呈现时，用50ml 灭菌的双蒸水或TE-buffer冲洗膜。
