摘要 RNA干扰是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默机制，具有高度特异性。21 nt干扰性小RNA在哺乳动物细胞中可以诱导强有力的特异性RNAi作用，这一突破性研究进展开创了人类疾病治疗的新天地，RNAi 技术用于人类疾病治疗已受到极大关注，尤其在AIDS、乙肝和丙肝等病毒感染性疾病和肿瘤治疗中的应用研究最为活跃和深入，并取得了令人鼓舞的成果。本文对siRNA的设计、制备，及其在病毒性疾病和肿瘤治疗中的研究进展作一综述。
关键词：siRNA RNAi 肿瘤治疗 HIV 病毒性肝炎
RNAi （RNA interference，RNAi）是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制，由内源性或外源性dsRNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发。dsRNA 在细胞内被切割成21-25nt 干扰性小RNA（small interfering RNA，siRNA）， siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子，从而导致该基因不表达[1]。RNAi发现仅短短5年的时间，由于其高效性和高度特异性，RNAi 成为颇为理想的细胞水平基因敲除工具，并迅速成为后基因组时代功能基因组学研究中不可或缺的重要手段。然而，由于长的dsRNA（38-1000bp）在哺乳动物细胞中产生非特异的基因表达抑制，使得RNAi 技术用于哺乳动物中的研究相对滞后。直至2001年，Tuschl研究组通过采取21 nt siRNA 在哺乳动物细胞中诱导了强有力的特异性RNA干扰作用[3]，这一突破性研究进展开创了人类疾病治疗的新天地，在AIDS、乙肝和丙肝等病毒感染性疾病和肿瘤治疗中的应用研究最为活跃和深入，并取得了令人鼓舞的成果。本文对siRNA的设计、制备，以及在病毒性疾病和肿瘤治疗中的研究进展做一综述。
siRNA的设计、制备
在哺乳动物细胞中引发特异的基因沉默最有效的siRNA是21 nt siRNA[3]，其中19个碱基互补，两边3΄ 端各有2个碱基突出（通常是AA或UU）。基因抑制的有效性关键在于siRNA靶基因序列片段的选择，然而，目前为止人们并不知道mRNA的哪一个部位对 siRNA更敏感。通常随机选择3-4个靶位点进行设计siRNA，然后根据体外实验结果，筛选出最为有效的siRNA。考虑到mRNA 5΄ 端非编码区（untranslated regions，UTRs）通常有丰富的调控蛋白结合位点，调控蛋白与目的mRNA UTR区结合后可能会影响RISC复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)与mRNA结合降低抑制效果，通常人们避开此区域设计siRNA，但也有研究者持相反态度。 选出合适的靶序列后要同Genebank中的编码序列进行blast 序列分析是非常必要的，这可以避免与无关的mRNA序列同源[4]。目前有多种在线siRNA设计软件可供使用，详细情况请搜索相关网站（www.dharmacon.com, www.qiagen.com, www.ambion.com, ）。
化学合成法制备siRNA是目前最常用的方法，Dharmacon、QIAGEN 、Ambion等公司均可以提供高质量的化学合成siRNA，但费用昂贵。其他体外制备siRNA的方法还包括体外转录法和Rnase III（如Silencer siRNA Construction Kit，Ambion公司） 或Dicer 酶消化dsRNA法[5]。体外制备的siRNA需要专门的RNA转染试剂将其转到细胞内，在不同细胞内的转染效率存在较大差异，在原代细胞和T淋巴细胞中的转染效率低，转染到细胞内后作用时间较短，不能持久抑制基因表达。针对以上不足，结合过去20多年基因治疗的经验，人们构建了各种siRNA 表达载体或病毒载体，siRNA通过转染到细胞内的DNA模板转录而获得，在细胞内形成发卡结构的小RNA（short hairpin RNA, shRNA）。siRNA病毒载体的应用研究是目前研究的热点。目前RNAi常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体[6，7]。
RNAi 在抗病毒感染中的应用前景
1. RNAi 技术用于抗HIV治疗
2001年Tuschl研究组的突破性研究开创了RNAi技术治疗人类疾病的新途径，siRNA迅速成为治疗HIV的新武器。美国费城的Thomas Jefferson 大學生化及分子药理研究所Roger J. Pomerantz博士指出：将这项新颖的技术应用于人类疾病的治疗上可能有莫大的潜力。在AIDS的治疗上，RNA干扰可能成为对抗HIV病毒感染、复制的最有利方式。人们针对HIV生活周期的不同阶段设计了多种siRNA，针对HIV病毒gag、tat、rev、nef等基因的siRNA可用以控制病毒复制，针对宿主细胞的表面HIV受体基因的siRNA可用以控制病毒进入宿主细胞内，抑制病毒的感染过程[8]。
1.1 针对HIV基因组RNA的siRNA
Jacque等针对HIV病毒基因组的长末端重复序列(long terminal repeat ,LTR)、病毒vif和nef基因，设计合成了siRNA。他们将siRNA和HIV前病毒DNA共同转染CD4受体阳性的Hela细胞，病毒感染阳性细胞的比率同对照组相比降低了95%以上。诺贝尔生理医学奖得主Philip Sharp博士研究组设计合成了针对HIV gag 基因的anti-gag siRNA。研究证实针对病毒基因組的gag区域的siRNA可以有效的將病毒的基因“沉默”，抑制HIV病毒的复制能力[9]。Bauer 研究组通过载体在细胞内表达anti-rev siRNA，可明显降低HIV复制水平，作用持续时间达数天之久[10]。在体外细胞株培养条件下，人们利用RNAi技术成功的控制HIV在细胞内的复制能力，然而，将该项技术用于临床治疗尚有一定距离。首先，siRNA转染到原代T淋巴细胞比较困难是anti-HIV siRNA在临床应用上的一大障碍。其次，RNAi具有高度特异性，靶序列上一个碱基的差异即可导致抑制效果明显不同，而HIV逆转录酶的错配率较高（每个复制周期可达1/1000nt），可能会迅速产生病毒突变株逃避siRNA的抑制作用。再者，不同个体甚至同一个体内的HIV病毒基因组呈现序列复杂多样性，给siRNA的设计带来困难。
1.2 针对宿主细胞HIV受体的siRNA
由于HIV病毒基因组的复杂多样性和易突变性，单独针对某一病毒基因的siRNA可能无法达到令人满意的抑制病毒复制的效果，采取针对宿主细胞HIV受体的 siRNA以阻止病毒进入细胞内也许更具实用价值。CD4是HIV病毒与之结合并进入宿主细胞内的主要受体，Philip Sharp博士研究组发现，针对宿主细胞受体CD4的anti- CD4 siRNA可以有效抑制HIV病毒的感染能力，并进而影响其复制水平[10]。然而，CD4是人体正常免疫功能不可缺少的分子，它的表达抑制势必影响细胞免疫功能。在以往的研究中发现，T细胞共同受体CCR5的突变可以有效的保护细胞免受HIV-1的攻击，而不影响正常的免疫功能。由此可以设想针对 CCR5、CCR4等共同受体的siRNA或许具有更大的意义。此外，我们可以针对HIV感染和复制的不同阶段设计多种siRNA，多种siRNA联合应用很可能增强病毒抑制效果，也可以同其他抗HIV的药物合用。
2．RNAi技术用于治疗其他病毒性疾病的研究
RNAi技术除用于抗HIV研究以外，还用于抗其他多种病毒的探索。它们包括乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒（influenza virus）、脊髓灰质炎病毒（poliovirus）等[11,12]。以上研究均取得了另人欣喜的体外病毒抑制作用，但体内清除病毒的效果尚须在动物实验模型中进一步验证。RNAi技术可能会给病毒治疗带来一场革命，但真正用于抗病毒治疗还有待进一步验证。
RNAi 在抗肿瘤治疗中的应用前景
1.RNAi用于抑制癌基因表达
原癌基因是细胞基因组中的正常组成成分，在自然状态下无致癌作用，主要作用是通过编码生长因子、受体和细胞内信息传递物质调节正常细胞的生长、分裂和分化。原癌基因的活化主要包括点突变、插入突变、基因扩增和染色体重排。以上各种类型的活化的癌基因的mRNA均可以采取RNAi 技术得到抑制，从而抑制肿瘤的生长。
1.1 RNAi 技术用于敲除点突变激活的癌基因
RNAi 技术是敲除点突变激活的癌基因的理想武器。K- ras 基因成为第一个采用RNAi 技术敲除的癌基因。ras基因是目前已知在人类肿瘤中最普遍呈活化状态的致癌基因，此基因的突变現象存在于30-50%的肿瘤组织中，在胰腺癌可达 85%。突变的ras 基因与正常细胞中的野生型ras 基因通常只有一个碱基的不同，但由于RNAi 的高度特异性，可以针对肿瘤细胞中突变的ras产生抑制作用，而对正常细胞中的野生型ras不产生抑制作用。Agami研究组采用逆转录病毒载体 shRNA表达系统不仅特异性地在体外抑制了CAPAN-1胰腺癌细胞内的K- ras 基因的表达，也成功的抑制了裸鼠移植瘤的生长[13]。
1.2 RNAi 技术用于抑制基因扩增
基因扩增是指原癌基因通过某种机制在原来染色体上复制出多个拷贝数，导致表达产物异常增多，细胞增殖。 EGFR（erbB1）在乳腺癌和肺癌等多种上皮性肿瘤中发生基因扩增，在肿瘤发生中起重要作用。德国Jovin研究组通过化学合成的anti- erbB1 siRNA成功的抑制了A431细胞内erbB1的表达，导致细胞凋亡增加和肿瘤增殖减弱[14]。
1.3 RNAi 技术用于抑制融合基因表达
染色体重排是指癌基因从所在染色体的正常位置上易位至另一个染色体的某一位置上，使起调控发生改变转为激活状态，产生异常基因产物，导致细胞恶性增殖。BCR/ABL融合基因是定位于人9号染色体9q34上的C-ABL基因和22号染色体22q11 上的BCR基因发生t（9：22）易位，使相应的无关的基因发生融合而形成的，它是Ph 染色体的分子基础，在慢性粒细胞性白血病（CML）发病中起到重要作用。Borkhardt等采用RNAi 技术成功的抑制了K562白血病细胞中的BCR/ABL融合基因mRNA的表达[15]。
2.RNAi用于抑制其他与肿瘤发生发展相关基因的表达
肿瘤发生发展过程中除癌基因激活外，还涉及到多种形式的基因改变。bcl-2 是与血液系统恶性肿瘤密切相关的抗凋亡基因，可以阻遏化疗药物诱导的肿瘤细胞的凋亡。raf-1和白血病的发生和耐药性也有密切联系。抑制bcl-2 和raf-1 mRNA的表达可以抑制白血病细胞的增殖[[16]。抑制肿瘤血管的生成是肿瘤治疗的又一策略，anti- VEGF siRNA可以特异性的抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，抑制肿瘤的生长[17]。肿瘤的耐药性和多药耐药基因（multidrug resistance，MDR）的表达有关，通过anti- MDR siRNA可以抑制细胞的耐药产生[18]。
如何在体内实现靶基因siRNA转移到所有肿瘤细胞并稳定持久的抑制癌基的表达是RNAi技术治疗肿瘤的关键。此外，从目前RNAi的研究现状来看，在哺乳动物细胞中，RNAi并不能完全阻断基因的表达，尤其是异常高表达的基因[3], 这也将影响对肿瘤的治疗疗效。尽管如此，但RNAi的高效特异性抑制癌基因表达以及明显优于反义核酸的效果的特征显示: RNAi将是一项令人不可忽视的抗肿瘤新技术。
2002年12月20日, Small RNA " RNAi 被Science杂志评为年度十大科技成就之首，Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成果之一。RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20年来，可与人类基因组计划（human genomics program，HGP）相提并论的最重大成果之一。RNAi最主要的功能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。人们对小 RNA分子的深入研究必将大大推进基因功能的研究，更为各种病毒性疾病和肿瘤等疾病的根治，开辟新的治疗途径。Small RNA与RNAi的研究与应用，具有极其重要的理论和实际意义，它必将对生物学和医学的发展产生深远的影响。
