1 RNA 的提取
RNA 提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。在有EB 存在时，完整未降解的RNA制品电泳图谱应可清晰看到18S rRNA、28S rRNA 两条带，也应当能看到一条由tRNA、5.8S rRNA 和5S rRNA 组成的、较模糊迁移较快的条带，且28S rRNA 条带亮度应为18S rRNA的1.5-2 倍。
附图：本公司RISOTM RNA 抽提试剂盒与其他公司产品的比较 Line 1、2、3：国内某3 家公司RNA 抽提试剂；Line 4：本公司RISOTM RNA 抽提试剂；Line 5：国外某公司 RNA 抽提试剂
1.1 试剂耗材的准备：
1） 试剂：
A. RNase-Free 水：配0.01 % (v/v)的Diethylpyrocarbonate（DEPC）溶液，室温保持过夜，次日高压灭菌后，- 20 ℃ 保存。
B. 氯仿 (Chloroform)，异丙醇（Isopropyl alcohol），分子生物学级别
C. 75% 乙醇 (用 DEPC-treated 水配制)
2） RNase 去除的耗材：用0.01% (v/v) DEPC 溶液完全浸泡过夜，高压灭菌后烘干。
1.2 实验步骤：
1） 准备分离RNA 的细胞：
I. 悬浮细胞：
收集细胞，离心200 g，5 min。吸出培养液。每106 个细胞加入1 mL Trizol 裂解液，反复吹吸3 - 5 次，室温下静置10 min 后转移至干净的离心管中。
II. 贴壁细胞：
吸出培养液，每10 cm2 生长面积的细胞加入1 mL Trizol 裂解液，反复吹吸3 - 5次，室温下静置10 min 后转移至干净的离心管中。
2） 加入0.2 mL 氯仿（/ mL Trizol），振荡15 sec 混匀后静置2 min。
3） 在4 oC，12,000 g 离心15 min，混合液分成三层。
（以下所有步骤用到耗材均需用DEPC 处理并高压灭菌。）
4） 小心吸取最上层的无色水层于干净的离心管中。加入0.5 mL 异丙醇（/ mL Trizol），室温下静置10 min。
5） 在4 oC，12,000 g 离心10 min，弃上清，加入1 mL 75% 乙醇（/ mL Trizol），振荡混匀。
6） 在4 oC，7,500 g 离心5 min，弃上清。室温下完全干燥5 - 10 min。
7） 加入RNase‐Free 水溶解RNA 沉淀，分装后在 ‐ 80 ℃ 保存。
2 实时定量荧光PCR
实时荧光定量PCR（Real Time PCR，qRT-PCR）避免了传统PCR 以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。与常规PCR 相比，实时荧光定量PCR 具有特异性更强、有效解决PCR 污染问题、自动化程度高等特点，已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA 表达量的变化；比较不同组织的mRNA 表达差异；验证基因芯片，siRNA 干扰的实验结果。它涉及到DNA 或RNA 样品制备，反转录及PCR 反应等一系列重要的分子生物学过程。
2.1 设计目的片段和内参基因的qPCR 引物：利用Primer5.0 等软件设计PCR 引物及探针。我们公司免费为客户设计引物和探针。
2.2 SYBR Green 法：
2） PCR 反应条件如下：
*与引物的Tm 相关
3） 取5μl PCR 产物跑1.5%琼脂糖凝胶电泳，或做溶解曲线，检测PCR 产物的特异性
2.3 Taqman 法
1） 建立以下反应体系
2） PCR 反应条件如下：
5.2.4 实验完毕之后，将数据导入到Excel 中进行数据分析。
5.2.5 结果分析：
利用ΔΔCt 法，相对定量，将目的基因的表达与看家基因的表达对比，获得沉默效果。如下图所示：
