真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA
一、试剂准备
1．3M醋酸钠（pH 5.2）
2．0.1M NaOH
3．1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为 0.1%。
4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．无水乙醇、70%乙醇
6．DEPC
二、操作步骤
1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。
3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。
5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。
6．用5-10倍柱床体积的 1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。
7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1 /2柱体积。
8．OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。
9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。
10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事项
1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2．步骤（4）中将RNA溶液置 65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。
5．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
逆转录-聚合酶链反应
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择
1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的 RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA引物的选择
1． 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于 Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
二、 试剂准备
1．RMA提取试剂
2．第一链cDNA合成试剂盒
3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4．Taq DNA聚合酶
三、操作步骤
1. 总RNA的提取：见相关内容。
2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
（3）加入SuperscriptⅡ 1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
（4）于70℃加热15min以终止反应。
（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
3．PCR：
（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA 2μl
上游引物（10pM） 2μl
下游引物（10pM） 2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl） 1μl
（２） 加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
（３） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
（４） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
（５） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
四、注意事项
1． 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。
2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3． 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5． 防止DNA的污染：
（１） 采用DNA酶处理RNA样品。
（２） 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。
Northern Blot
继分析DNA 的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含poly A尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。
与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标 RNA的丰度）。但与Soughern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。
一、 试剂准备
1. 0.5M EDTA: EDTA 16.61g加ddH2O至80ml, 调pH至8.0, 定容至100ml。
2． 50mM NaAc: NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml, 加DEPC 0.5ml, 振荡, 37℃过夜，高压灭菌。
3． 5×甲醛凝胶电泳缓冲液: MOPS [3-(N-玛琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml, 用2N NaOH调pH至7.0, 再加入0.5M EDTA 10ml, 加DEPC H2O至500ml。无菌抽滤，室温避光保存。
4． 20×SSC: NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O至800ml，用2N NaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。
5. 6×SSC: 20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml。DEPC处理,高压灭菌。
6．50×Denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml,无菌抽滤、分装。
7．1M Na2HPO4: Na2HPO4•12H2O 35.81g, 加dd H2O至100ml。
8. 1M NaH2PO4: NaH2PO4•2H2O 15.6g, 加dd H2O至100ml。
9. 0.1M 磷酸钠缓冲液(pH 6.6): Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
10.STE缓冲液: 1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml,0.5M EDTA, 0.5ml,5M NaCl 5ml，加dd H2O至250ml。
11.预杂交液: 20×SSC 5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt 4ml,1M磷酸钠缓冲液0.2ml（pH6.6）,10%SDS 1ml, 总体积 20ml。临用前加入变性鲑鱼精DNA（10mg/ml）,使终浓度为4μl/ml。
12. DEPC H2O: 1000mldd H2O中加入DEPC 1ml，充分振荡，37℃过夜，高压灭菌。
二、操作步骤
1. 总RNA提取：见相关内容。
2. 变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPC H2O 12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。
3. 样品制备：取总RNA4.5μl(约20-30μg) ，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液 4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃温育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上样缓冲液2μl。
4. 电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。
5. 将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：
(1) 按胶块大小剪取膜一张，用DEPC水中浸湿后，置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。
(2)将胶块切去一角，并在20×SSC浸泡 15min×2次。
(3)用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台，将其放入大的干烤皿上，上面放一张Whatman 3MM滤纸，倒入20×SSC使液面略低于平台表面，当平台上方的3MM滤纸湿透后，用玻棒赶出所有气泡。
(4)将凝胶翻转后置于平台上湿润的 3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。
(5)用Parafilm膜围绕凝胶四周，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。
(6) 在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜，排除膜与凝胶之间的气泡。
(7) 将二张已湿润的、与凝胶大小相同的3MM滤纸置于膜的上方，排除滤纸与滤膜之间的气泡。
(8) 将一叠（5-8cm厚）略小于3MM滤纸的纸巾置于3MM滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃，然后用一个重约500克的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。
6.使上述RNA转移持续进行15hr左右。在转膜过程中，当纸巾浸湿后，应更换新的纸巾。
7.转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。将膜在6×SSC中浸泡5 min，以去除膜上残留的凝胶。
8. 将凝胶置紫外灯下，观察胶块上有无残留的RNA。
9.膜置80℃，真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保存备用。
10. 探针标记(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)：
（1） 取模板DNA 25ng于0.5ml离心管中，95-100℃变性5min，冰浴5min。
（2） dNTPmix的制备: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混匀。
（3）将下列反应成份混合，加入上述微量离心管中：
dNTPmix 2.0μl
BSA(10mg/ml ) 2.0μl
5×buffer 10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP 5.0μl
加入适量dd H2O使反应总体积达50μl，轻轻混匀。室温下反应1hr。
11.预杂交：将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42℃预杂交3hr。
12.杂交：将变性的探针（95-100℃变性5min，冰浴5min）加入到预杂交液中，42℃杂交 16hr。
13.洗膜：
(1)倾去杂交液。
(2)2×SSC/0.1%SDS室温洗15min。
(3)0.2×SSC/0.1%SDS，55℃ 洗15min×2次。
14.压片：将膜用dd H2O漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上X光片。暗盒置-70℃放射自显影3～7天左右。
三、注意事项
1．操作时必须仔细、小心，严格按同位素操作规程进行，以防止同位素污染。
2．必要时，可采用Sephades G-50柱层析法纯化标记的探针（见本节附录），以去除标记反应中未结合的（游离的）核苷酸。
3．膜的重复使用：结合了待测RNA的膜与探针杂交后，可经碱或热变性方法将探针洗脱，膜可反复使用与其它探针杂交。方法如下：杂交的膜（注意：杂交过的膜在保存过程中不能干燥，否则探针将会与膜形成不可逆的结合）置 100℃ 0.5% SDS中煮沸3min，自然冷却至室温后，将膜放入双蒸水中漂洗2-3遍。取出膜，用滤纸吸去膜表面的水份。将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好，室温下真空保存。
RNA酶保护试验
RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：
1． 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。
2． 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。
3． 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。
4． 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。
5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。
6． 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。
7． 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。
RPA的缺点是需要同位素标记探针。
一、试剂准备
1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。
2. 杂交缓冲液:PIPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。
3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml
二、操作步骤
1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。
（1）设计含T7启动子的PCR引物
由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:
T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG
引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式 PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：
上游引物
下游引物Ⅱ T7 启动子序列
下游引物Ⅰ
（2）PCR
先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。
（3）探针合成标记与纯化
在0.5ml 离心管中加入下列试剂：
RNasin （40U/μl） 0.5μl
GACU POOL GAC
（含GTP、 CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM） 2μl
[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl
DTT (二硫苏糖醇，0.1M) 1μl
5×转录 buffer 2μl
模板（50ng/μl） 1μl
T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl
混合后，短暂离心，37OC保温1hr。
加入 DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。
加入：饱和酚 50μl
氯仿 50μl
酵母tRNA（2μg/μl） 4μl
DEPC H2O 100μl
室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4OC离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。
2．杂交
（1） RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。
（2）取8μl RNA加入1-3μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml 离心管中。
（2） 80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。
3. 消化
(1) 杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温30min。
(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 OC保温10min。
(3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。
(4) 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20OC 30min，4 OC离心,135000g×10min。
(5) 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。
4、电泳与放射自显影
（1）配制凝胶：(50ml)
40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1） 6.25ml
5×TBE 10ml
尿素 24g
加H2O至50ml
溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。
（2）预电泳
以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。
（3）加样
将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。
（3） 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。
三、注意事项
1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。
2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。
3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。
4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。
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mRNA 差别显示技术
mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。mRNA差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，进行mRNA反转录合成cDNA。此cDNA的合成是采用Oligo（dT）12 MN为引物，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12 MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类（目前较为流行的方法是进行4种归类，即M为简并碱基的形式存在），在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通过对组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多，很难用电泳系统加以快速准确地分离。因而需要对反转录产物cDNA进行归类处理，减轻不同PCR产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。（见示意图）
一、实验流程：
对照组的总RNA提取
mRNA完整性鉴定 实验组的总RNA提取
mRNA完整性鉴定
↓ ↓
锚定引物逆转录成cDNA 锚定引物逆转录成cDNA
↓ ↓
采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增 采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增
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扩增产物进行凝胶电泳分析
以差异性条带为探针克隆出基因组文库中的基因
序列及cDNA文库中的全长cDNA序列
基因功能的鉴定：
①knock out
②dominant negative mutation
③原核系统或真核系统中的表达翻译。抗体的制
> 备，细胞内的定位，抗体抑活等等。
④one hybrid判断出该基因的“启动”基因。
⑤two hybrid判断出该基因的产物的作用途径。
这里以CLONTECH公司生产的 DeltaTM Differential Display Kit为例，介绍具体的实验步骤。该试剂盒中含有10种任意引物和9种Oligo(dT)引物。
二、 > 操作步骤
1．总RNA的提取（见Northern 杂交）
2．第一链合成：
(1)总RNA样品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O补至5μl。将管标号为1A,2A,PC A等。PC为阳性对照。
(2)混匀后稍离心。
(3）70℃孵育3min，冰浴2min后稍离心。
(4）准备dNTP mix (以5管为例 )
> > > > 每管 > > 5管
5×第一链缓冲液 > > 2μl > > 10μl
dNTPmix（各5mM） > > 2μl > > 10μl
MMLV逆转录酶（200u/μl） > 1μl > > 5μl
> > > > 5μl > > 25μl
(5）每管加入5μl，混匀后稍离心。
(6）42℃孵育 1hr。
(7）75℃ 10min终止反应后置冰上，稍离心。
(8)将2μl反应液分别转至新管中（新管标号为1B,2B,PC B等）。
(9) 将78μl ddH2O分别加入B管中,混匀。
(10)将72μl ddH2O分别加入A管中，混匀。
(11）将所有cDNA稀释液 -20℃保存待用。
3．dd-PCR: 以 引物P1,T9为例说明
> （0.5ml>PCR管,1代表对照组,2代表实验组）
管号 > > cDNA样品 > > 引物
(1) > > 1A > > > P1,T9
(2) > > 1B > > > P1,T9
(3) > > 2A > > > P1,T9
(4) > > 2B > > > P1,T9
(5) > > H2O > > > P1,T9
(6) > > RNA1 > > > P1,T9
(7) > > RNA2 > > > P1,T9
以下为阳性对照反应体系
(8) > > PC 1A > > > P10,T8
(9) > > PC 1B > > > P10,T8
(10) > > PC 2A > > > P10,T8
(11) > > PC 2B > > > P10,T8
(12) > > H2O > > > P10,T8
(13) > > PC RNA1 > > P10,T8
(14) > > PC RNA2 > > P10,T8>
在PCR 管中加入:
① cDNA样品 > > 1μl
P引物 > > 1μl
T 引物 > > 1μl
② 准备其它>PCR试剂的混合液: (在另一管中加入)
成分 > 每管(μl) > 所需管数( n=14)
10×buffer > 2.0 > > 2n
ddH2O > 14.0 > > 14n
dNTPmix > 0.2 > > 0.2n
α-32P dATP > 0.4 > > 0.4n
Taq酶 > > 0.4 > > 0.4n
终体积 > 17.0 > > 17 n>
混匀后稍离心。
③ 将17μlPCR混合液加入各反应管，则各管总体积为20μl。
④ 开始PCR扩增。
⑤ PCR循环参数：
在GeneAmp PCR Systems 2400 " 9600 扩增仪上执行以下程序：
94℃ 5min
1 cycles 40℃ 5min
68℃ 5min
94℃ 30sec
2 cycles 40℃ 30sec
68℃ 5min
94℃ 20sec
23 cycles 40℃ 30sec
68℃ 2min
1 cycles 68℃ 7 min。
⑥ 反应结束后置-20℃保存备用。
4．电泳和放射自显影
(1）配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注测序板。
(2）预电泳30min。
(3）每个dd-PCR反应取出5μl于一新微量离心管中，加5μl loading
buffer，混匀，离心，置94℃变性2min。立即置冰浴。
(4) 停止预电泳，冲洗加样孔。
(5)加样2μl。70W电泳2.75hr至二甲苯青到达胶的底部。
(6）下胶：（同测序胶）
(7）干胶：在胶表面覆上保鲜膜，80℃干胶30min。
(8)X光片-70℃曝光过夜或更长时间(根据射线强度而定)。
图2-6显示了dd- PCR放射自显影的X光片
5．差异条带回收再扩增
(1）X光片经D72显影、酸性定影液定影后，水洗晾干。置X光片灯上比较寻找差异条带。
(1) 用一次性手术刀片在胶上切割差异条带，加ddH2O 20μl，沸水浴15min，离心取上清为模板。
(3) 以原引物扩增：
回收DNA 7 μl
10×PCR buffer 5 μl
5mM dNTPmix 0.5 μl
引物P 2.5 μl
引物T 2.5 μl
Taq酶 2 μl
加ddH2O至总体积为50μl
(4) 执行PCR程序:
93℃3min；93℃1min→60℃1min→68℃2min，20 次循环；68℃5min。
(5) 取PCR产物10μl 2%琼脂糖电泳检测。
(6) PCR产物乙醇沉淀，10μlddH2O溶解。
6．以PCR产物为探针，标记后进行Northern杂交，证实基因的真实性。
7．PCR 产物的TA克隆。
8．DNA序列测定。
9．检索分析。
