梁德勇 徐国恒 崔振中 王晓民 朱丽霞 韩济生
RNA是分子生物学研究的一个重要组成部分， 不论是cDNA文库的构建、RT-PCR、RNA序列分析、差异显示（mRNA differential display）、代表性差异分析 (representational Difference Analysis, RDA)、抑制性消减杂交（suppression Subtraction Hybridization, SSH）、Northern印迹分析、蛋白质的体外翻译等均依赖于高纯度完整的RNA。 因此, 如何获得高质量的RNA是研究人员关注的问题。1987年Chomczynski等［1］建立了酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法（acid-guanidine-phenol-chloroform, AGPC）。该方法较以往的传统方法操作简单，无需特殊的设备，抽提时间缩短至4 h，因而得到广泛的应用。数家公司据此开发出RNA提取试剂盒［2，3］。使用试剂盒简单方便，但价格相对昂贵。为探索操作简便、经济实用、快速有效的RNA提取方法，我们分析了大量相关文献资料，进行了多次实验，成功地研制出一种新型的RNA提取试剂，建立了其操作程序，我们称之为RNA快速提取一步法。其性能达到进口试剂盒的水平，但造价低廉、操作简便，特别适用于国内实验室。
1 材料与方法
1.1 试剂
变性液（4 mol.L－1异硫氰酸胍，25 mmol.L－1柠檬酸钠pH 7.0，5 g.L－1十二烷基肌氨酸钠,0.1 mol.L－1β－巯基乙醇），按文献［1］方法配制；2 mol.L－1的乙酸钠；重蒸酚；氯仿；异丙醇；8－羟基喹啉；柠檬酸；柠檬酸钠；乙酸；乙酸钠；800 ml.L－1乙醇；RNAzol试剂盒(Promega 公司)；Trireagent (Sigma 公司)。
1.2 仪器
电泳仪、岛津UV-160型紫外可见分光光度计（日本产）、超声匀浆仪（美国Sonics Material Inc. Jencons产品）、玻璃匀浆器。所用器皿均按RNA提取的一般要求进行处理［4］。
1.3 标本
大鼠脑组织、脊髓组织、培养细胞。
1.4 RNA快速提取试剂的制备
1.4.1 酸酚的平衡 取重蒸酚于65℃水浴融化, 加入1 g.L－18-羟基喹啉；用50 mmol.L－1乙酸钠（pH 4.0）平衡。在平衡的过程中不断搅拌，并反复更换乙酸钠，待上清液相的pH值达到4.1为止。
1.4.2 CSB缓冲液的配制 用DEPC处理过的纯水配制CSB缓冲液，由42 mmol.L－1柠檬酸钠、8.3 g.L－1十二烷基肌氨酸钠和0.1 mol.L－1β- 巯基乙醇组成。
1.4.3 快速RNA提取试剂的配制 用CSB缓冲液配制4 mol.L－1异硫氰酸胍；加入0.1体积4 mol.L－1乙酸钠（pH4.0）, 加入等体积酸酚，0.02体积的异戊醇，混匀，即为RNA快速提取试剂。4℃保存备用。
1.5 RNA快速提取程序
组织RNA的提取： 将约10～100 mg的组织块置于匀浆仪中，加入1 ml RNA快速提取试剂，进行匀浆；将匀浆液倾入1.5 ml离心管中，加入0.1体积的氯仿，振荡混合20 s；冰上放置5 min；4℃离心12 000 r.min－1, 15 min。离心管中的液体分为3层: 上层为无色透明的无机相，RNA保留于此相中；下层为呈淡黄色的有机相，蛋白质保留于此相中；上下两层的界面处为中间层，DNA保留于此相中。小心吸取上层水相约0.5 ml于新管中，切勿吸取中间层和下层液体，以避免DNA和蛋白质的污染。异丙醇沉淀：加入等体积的－20℃预冷的异丙醇，混匀，4℃离心12 000 r.min－1，15 min, 弃上清；用0.5 ml预冷的80％(体积分数)乙醇洗涤沉淀，弃尽乙醇，在空气中自然干燥，溶于适量DEPC处理的水中，用于后续的实验或－80℃保存。培养细胞RNA的提取： 培养细胞生长至旺盛期，弃掉培养基，用冰冷的PBS缓冲液冲洗两次，直接向细胞中加入1～2 ml RNA快速提取试剂，轻轻晃动培养瓶使细胞与RNA快速提取试剂充分接触，冰上放置5 min，吸出粘稠的细胞裂解混合物于新的离心管中，加入0.1体积的氯仿，振荡混匀。其余步骤与上述组织RNA提取方法相同。传统一步法提取RNA，按文献［1］方法进行；用Trireagent 或RNAzol提取RNA，按试剂盒说明操作。
1.6 RNA的质量、纯度鉴定和浓度测定
取1～2 μl RNA样品在15 g.L－1琼脂糖凝胶上进行电泳，检查RNA的质量，主要观察28 S、18 S和5 S三条带是否清晰，有无降解，以及是否有DNA污染。
取1～2 μl RNA样品溶于1 ml超纯水中，用紫外分光光度法测定D值。以D260值计算其浓度，计算公式:
质量浓度(g.L－1)=40×D260× 稀释倍数/1000
以D260/D280的比值表示其纯度，比值在1.8～2.0之间为纯的 RNA，比值低于1.8，说明RNA样品有蛋白质或酚的污染，需要用氯仿重新抽提。
2 结果
2.1 RNA的完整性
用快速一步法提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，显示清晰的28 S，18 S和5 S三条带，表明RNA无降解、无明显的DNA污染，图1给出了一个代表性的实验结果，图2是用传统方法提取的电泳图，有较多的DNA污染。紫外分光光度法检查，图1脑组织RNA样品D260/D280的比值均在1.8～2.0之间，说明RNA未被蛋白质、酚污染，是高纯度的。用两种试剂盒提取的RNA与本法结果相似（图略）。用快速一步法提取的关节炎大鼠脊髓RNA作模板，进行DDRT-PCR，获得成功(图 3)。
1，test;
图1 用快速一步法提取大鼠脑组织RNA的电泳图
Figure 1 Electrophoresis map of brain RNA by rapid one-step method
2,control.
图2 用传统方法提取大鼠脑组织RNA的电泳图
Figure 2 Electrophoresis map of brain RNA by acid-guanidine-phenol-chloroform (AGPC) method
图3 关节炎大鼠脊髓组织RNA样品的差异显示结果
Figure 3 Differential display map of spinal cord from arthritis rat
2.2 操作程序的比较
快速RNA提取方法与传统的一步法相比，省掉了变性液复溶和异丙醇二次沉淀.
同时也对其它参数进行了调整，使整个RNA的提取过程由原来的4 h缩短至1 h以内，这与试剂盒的方法一致。
见表1
表1 4种RNA提取方法的比较
Table 1 Comparison of four RNA extraction methods
| Steps | AGPC method |
One-step method (in this paper) |
RNAzol | Trireagent |
| Centrifuge | 20 min | 15 min | 15 min | 15 min |
| Precipitation | Isopropyl alcohol | Isopropyl alcohol | Isopropyl alcohol | Isopropyl alcohol |
| At least 60 min | 15 min | 15 min | 15 min | |
| Centrifuge | 20 min | 10 min | 10 min | 10 min |
| Re-dissolve | Denature Solution | no | no | no |
| Re-precipitation30 min | no | no |
no |
|
| Centrifuge | 10 min | no | no | no |
| Washing | 800 ml.L－1ethanol | 800 ml.L－1ethanol | 800 ml.L－1ethanol | 800 ml.L－1ethanol |
| Dissolve | H2O | H2O | H2O | H2O |
| Total time | 240 min | 60 min | 60 min | 60 min |
2.3 RNA快速提取试剂的稳定性
在实验中发现，按传统一步法配制的变性液稳定性不好，易出现浑浊，甚至析出结晶等不良现象。我们配制的RNA快速提取试剂4℃长期保存无浑浊、结晶析出等不良现象。用4℃保存3个月、6个月和12个月的试剂分别提取RNA，进行琼脂糖电泳鉴定无降解，表明该试剂具有很好的稳定性，可以长期保存使用，有效期至少是1年。
2.4 匀浆方式对RNA质量的影响
在实验中我们发现不同的匀浆方式对RNA的质量有明显的影响。通过反复实验发现，用超声匀浆仪匀浆易引起RNA的降解，且RNA的回收率很低；用手动玻璃匀浆器进行组织匀浆，获得的RNA无降解，回收率高，而且操作简单，是一种较理想的组织匀浆方式。
3 讨论
对任何一种RNA提取方式的评价，首先要评价该方法是否能获得高纯度完整的RNA，这是评价一种方法有效性的根本指标。本实验结果表明，以一步法为基础建立的RNA快速提取一步法能够获得高纯度完整的RNA，其效果优于传统的一步法，与目前市售的进口试剂盒的效果基本一致。
完整的RNA取决于最大限度地避免提取纯化过程中内源及外源性的核糖核酸酶（RNA酶）对RNA的降解。采用高活性的 RNA酶抑制剂是防止RNA降解的有效方法。异硫氰酸胍是已知作用最强的蛋白变性剂，它在裂解细胞释放RNA 的同时能迅速使RNA酶失活，避免RNA被降解［5］。酸性环境有利于胍盐活性的发挥，能最大限度地发挥其对RNA酶的抑制作用；十二烷基肌氨酸钠和酚是强的蛋白变性剂，对RNA酶也有一定的抑制作用，使细胞裂解产生的各种蛋白迅速变性。酸性环境下RNA、蛋白质和DNA分别进入不同的分布相中，RNA进入上层水相，蛋白质进入下层有机相，DNA则进入位于上下两层界面处的中间层。氯仿不但有一定的蛋白变性作用，而且能迅速使各相分离，使RNA与其它成份分开。因此，由上述成份组成的RNA快速提取试剂构成获得高纯度完整RNA的基础。
按传统的一步法提取RNA，所用各种试剂需要分别加入，操作环节多，这将增加外源RNA酶污染RNA使其降解的机会，从而增加了操作难度。RNA快速提取试剂则把多种所需试剂，组合在一个溶液体系中，使组织破碎和抽提只需加一次试剂代替了传统方法多次加入试剂，这不但使操作简化，而且减少了外源RNA酶污染的机会。RNA快速提取试剂的另一特点是把多种成份组合在一起，较各成份单独存放更加稳定，能够长期保存。另外，RNA快速提取方法简化了传统一步法的操作程序，去掉了变性液复溶和异丙醇再次沉淀的步骤，这不但使操作简化，而且使RNA丢失减少，回收率增加，同时使RNA的提取周期由原来的4 h缩短至1 h，这不但节省了时间，提高了工作效率，而且减少了RNA降解的机会。
匀浆方式是影响从组织提取高纯度完整RNA的重要因素。 我们曾用超声匀仪浆对脑组织进行超声匀浆，提取RNA，屡遭失败。分析其原因可能有两个方面，一是超声匀浆产生大量的热，使RNA降解，另一方面超声匀浆的冲击力太大且作用不均匀，致使RNA的完整性遭到破坏。
总之，通过对传统一步法的改进，建立了RNA快速提取试剂和操作程序即RNA快速一步法。该方法操作简单，高效快速，经济实用。我们曾用该方法提取数百个RNA样品，用于RT-PCR、差异显示基因的筛选等多方面，均获得成功，显示了广阔的应用前景。
注：国家自然科学基金(39600192)资助项目。
作者单位：梁德勇 徐国恒 崔振中 王晓民 韩济生 北京医科大学神经科学研究所，北京 100083
朱丽霞 中国中医研究院针灸研究所
参考文献
1 Chomcznki P， Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem， 1987, 162:156-159
2 Chevillard S. A method for sequential extraction of RAN and DNA from the sample, specially designed for a limited supply of biological material. Biotechniques， 1993, 1:22-24
3 Chomczynski P. A reagent for the Single-step Simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques, 1993, 15:523-537
4 Sambrook P， Fritsch EF， Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.343-344
5 Han JH., Stratowa C, Rutter WJ. Isolation of full-length putative rat lysophosphipase cDNA using improved methods for mRNA isolation and cDNA cloning. Biochemisty, 1987， 26: 1617
6 Wallace DM.. Large- and small- scale Phenol extractions. Meth Enzymol， 1987, 152: 33～41
