一、实验目的
通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法
二、实验原理
RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的 RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
三、仪器、药品与试剂配方
(一) 仪器
1． 低温离心机
2． 分光光度计
3． 琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜，之后再用DEPC水浸泡冲洗。
4． 高压灭菌锅
5． 研钵、剪刀、一次性手套等
(二) 药品
1. 焦碳酸二乙酯(DEPC)
2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS)
3. 异硫氰酸胍
4. 醋酸钠(NaAc)
5. 氯仿
6. 苯酚
7. 甲醛
8. 乙醇
9. 乙二胺四乙酸(EDTA)
10. 琼脂糖
11. 异丙醇
(三) 试剂配方
1． 0.1% DEPC水
0.1 ml DEPC 加入 100 ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。
2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L异硫氰酸胍、 4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。
3. 5ΧMOPS 电泳缓冲液 (pH 7.0)
MOPS 0.1 mol/L
NaAc 40 mmol/L
EDTA 5 mmol/L
四、实验步骤
（一） 总RNA的提取（方案一）
1. 实验前10天左右播种水稻种子，在3-4叶期，剪取1.2 g幼叶。放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10 mL离心管。加入
4 mol/L异硫氰酸胍 4 mL
苯酚 3 mL
2 mol/L NaAc (pH 4.8) 0.3 mL
氯仿 0.6 mL
混匀，冰浴放置30 min。
2. 4℃，8000 r/min，离心13 min。
3. 弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。
4. 加入2倍体积无水乙醇，-70℃，0.5 h。
5. 4℃，8000 r/min，离心13 min。
6. 弃上清，在沉淀中加入1 mL 4 mol/L LiCl，使其溶解。
7. 移入1.5 mL离心管中，冰浴2 h。
8. 4℃，13000 r/min，离心15 min。
9. 弃上清，在沉淀中加入400 uL DEPC水，再加入400 uL氯仿，混匀。
10. 4℃，13000 r/min，离心6 min。
11. 取上清，并加入1/10体积3 mol/L NaAc（pH 5.0），2倍体积无水乙醇，-20℃，放置 30 min。
12. 4℃，13000 r/min，离心20 min。
13. 将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次。
14. 将沉淀RNA室温下稍干燥。
15. 加30 uL DEPC水溶解，-70℃保存。
（二） 总RNA的提取（方案二）
利用TRIzol提取液抽提RNA，具体步骤如下：
1. 取幼叶约250 mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5 ml离心管；
2. 加入1 ml TRIZOL提取液震荡摇匀；
3. 室温放置5 min后，加入0.5 ml的氯仿，剧烈摇动离心管5 min；
4. 在 8℃条件下，12000 rpm离心15 min；
5. 溶液分为两层，下层为酚－氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管， 加入 0.5 ml异丙醇在15~30℃条件下，沉淀10 min；
6. 然后在, 2~8℃条件下，12000 rpm离心10 min，RNA沉淀管壁和底部；
7. 去掉液体部分，加入1 ml 75%酒精洗2次；
8. 风干后，加入25 µl DEPC处理过的水溶解 RNA，储藏于-80℃冰箱备用。
（三）甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA
1．配制1.2%变性琼脂糖凝胶 (40 mL)
称取0.48 g,加入DEPC水25.2 mL,5X电泳缓冲液4 mL, 加热使溶解，稍冷却加入甲醛 3.4 mL, 混匀，室温凝固0.5-1 h.
2. RNA电泳检测样品制备
|
|
混合液轻轻混匀并离心，放于65℃下温育 5 min后，置于冰上。
3. 电泳检测
将1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加 1×MOPS电泳缓冲液，覆盖凝胶约1 mm。将RNA样品加到凝胶点样孔中，在5 V/cm条件下电泳30 min，然后在EB中染色 15-20 min，在紫外灯下观察提取的RNA的质量。
五、注意事项
1．在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。
2．RNA 酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。
