曹廷兵,叶治家,巩　燕,彭家和　　(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室,400038 重庆)

 

提　要:

目的　建立一种快速鉴定RNA 完整性的方法。方法　在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上,结合甲醛变性琼脂糖凝胶电泳加以改进而成。

结果　提取的总RNA 用此方法电泳后可得到28S、18S、5. 8S(5S) 三条清晰的rRNA 条带。

结论　此方法可以达到对RNA 完整性进行快速鉴定的目的。

　随着分子生物学技术的迅猛发展及在医学领域中的普及,以RNA 为研究对象的实验与日俱增。RNA 质量的好坏直接关系到后续实验的成败。Northern 印迹杂交分析、寡聚(Oligdt) 纤维素选择分离mRNA、cDNA合成及体外翻译等实验的成败,在很大程度上取决于RNA 的质量。因此在进行这些实验之前对RNA 的质量进行快速可靠的鉴定就十分必要。目前RNA 的质量采用变性琼脂糖凝胶电泳方法来鉴定[1 ] ,这些方法步骤繁琐、费时、费力。我室在长期进行RNA 的研究中,摸索出了一套稳定、快速和可靠的鉴定RNA 质量的方法,现报道如下。

1 　材料与方法

1. 1 　主要试剂

　　提取RNA 的TriPure Isolation Reagent 试剂盒、DEPC 等购自B.M公司,常规试剂如琼脂糖等为进口或国产AR 级以上。

1. 2 　RNA 的提取

　　以人胎盘组织提取总RNA ,方法按TriPure Isolation Reagent试剂盒说明书进行。对提取的RNA 在紫外分光光度计上测A260值和A260/ A280比值,确定所提取RNA 的浓度和纯度。

1. 3 　RNA 的琼脂糖凝胶电泳

　　电泳方法、步骤大体同文献[ 2 ]中的琼脂糖凝胶电泳。为最大限度降低RNA 在电泳时被降解,结合甲醛变性琼脂凝胶电泳分离RNA 方法[1 ] ,在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上进行如下改进。①电泳RNA 所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用肥皂粉洗干净后用双蒸水冲洗二遍后在室温晾干备用。②用新的1XTBE 配制1. 2 %琼脂糖凝胶,倒胶时溴化乙锭(EB)直接加入凝胶中。③制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的1XTBE ,液面只能刚好同胶面平齐,缓冲液不要淹过胶面。④点样时,样品RNA 每10μl 加入2μl 上样缓冲液,上样缓冲液是用DEPC 处理的水配制的50 %甘油,另外单独点一样品孔含有3μl 溴酚蓝的上样缓冲液作为电泳指示剂,电泳电压4 V/ cm ,电泳时间2 h 左右便可取出凝胶在紫外灯下观看所提取的RNA 的质量或进行拍照记录。

2 　结果

　　取人胎盘组织RNA 3μg 和6μg ,按本方法以1. 2 %的琼脂糖凝胶进行电泳,可见28S、18S、5. 8S(5S) 三条清晰的rRNA 条带。电泳结果见图1。

　3 讨论

　　RNA 作为分子生物学的主要研究对象之一,但它极易受到RNase 的水解,在进行RNA 操作时主要是避免外源RNase 的污染,特别是在得到RNA 沉淀以后,无RNase 抑制剂存在的条件下尤其如此。因此, 在RNA 操作过程中必须对所有实验材料进行彻底的处理,灭活RNase ,如EP 管、Tip 头等;另外,有一个良好的操作环境也是非常的重要。

　　RNA 质量如何、是否被降解通常采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳方法来鉴定。此电泳的主要目的之一是为了Northern blot 之用。但在RNA 的其他用途中,如cDNA 合成和寡聚(OligdT) 纤维素选择分离mRNA 等实验中要对RNA 进行质量鉴定,此方法就现得繁琐、费时、费力,而用常规琼脂糖凝胶电泳RNA 会水解而达不到鉴定的目的,如果用本研究改进的1. 2 %琼脂糖凝胶方法电泳鉴定,简单、高效、经济实用,并且能达到同用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳相同的实验结果。因此本方法在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上所作的每一项改进均是为了避免RNA 在电泳过程中被水解,比如对所有电泳器具彻底的清洗处理就是为了尽量清除器具上存在的RNase ;在RNA 样品中加入用DEPC 水配制的50 %甘油作为上样缓冲液,目的也是为了在RNA样品中避免加入其他试剂时造成RNase 的污染。

　　在提取的真核细胞总RNA 中核糖体RNA(rRNA)是28 S 清晰的带型,通常认为所提取的RNA 未被降解,可以用提取的RNA 进行后续实验。我们实验室还提取过多种组织RNA 如外周血淋巴细胞培养后的RNA、脂肪组织RNA、肝脏RNA 等,经此方法鉴定的RNA 的质量同分子克隆手册等参考书用变性琼脂糖凝胶鉴定的RNA 完全无异,结果稳定可靠。占总RNA 的90 %以上,它们主要由28 S、18 S、5. 8 S、5S 组成,28S(约4. 5 kb) 、18S(约2. 1 kb) 、5. 8 S(5 S) 这三类rRNA 的摩尔浓度大致相等,但他们的分子量相差较大,在紫外灯下的亮度依次为28 S < 18 S < 5. 8 S(5 S) 。在电泳后能观察到28 S、18 S、5. 8 S(5 S) ,特别是28 S 清晰的带型,通常认为所提取的RNA 未被降解,可以用提取的RNA 进行后续实验。我们实验室还提取过多种组织RNA 如外周血淋巴细胞培养后的RNA、脂肪组织RNA、肝脏RNA 等,经此方法鉴定的

RNA 的质量同分子克隆手册等参考书用变性琼脂糖凝胶鉴定的RNA 完全无异,结果稳定可靠.

参考文献

[1 ] J . 萨姆布鲁克, E. 弗里奇,T. 曼尼蒂斯著. 分子克隆实验指南 . 第2版. 北京:中国协和医科大学出版社,1999. 88 - 90.