实验原理
所有的氨基酸均为两性物质，即它们至少含有一個羧基（carboxyl）及一個氨基（α-amino）。這些可游离的基团随着pH变化可以三种形式存在，即正电荷（cation）、两性离子（zwitterion）及负电荷（anion）等三种，在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷。若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0，且在电场中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电点）。因为净电荷为零，净电斥力不存在的緣故，大部份蛋白质在等电点的pH值下，其溶解度最小。相反的，当溶液的pH值低于或高于pI，所有蛋白质分子所带净电荷为同号，彼此之间有相斥力，不会聚集。所以，將pH调到等电点的大小，则大部份的蛋白质將会沉淀，这种现象可以应用于估算某蛋白质的等电点；另一方面，也可以应用在电泳，达到分离蛋白质混合物的目的，这种方法称为等电聚焦电泳（isoelectric focusing），简称为IEF(见图4.8)。
图4.8 等电聚焦电泳示意图
上图左以A，B两种蛋白质为例，作出它们的净电荷曲线图，横轴代表环境中的pH值，纵轴代表蛋白質的净电荷，在 pH 6.5时，A带有两个正电荷，B带有一个负电荷。使A与B的净电荷为0的pH值分別为pH9和pH5，这就是它们的「等电点」。
IEF是在具有pH梯度环境中进行的电泳。将蛋白质置于不同pH梯度的胶体进行电泳，它会朝着与自身所带电荷相反的电极方向移动，直到抵达等电点（pI）相同的pH值处才停止，如果它移到別的pH处，会因为带电而再度移动到和它pI相符的pH处。
IEF-PAGE操作简单，只要一般电泳设备就可进行，电泳时间短、分別率高、应用范围广，可用于分离蛋白质及测定pI，也可用于临床鉴别诊断、农业、食品研究等各种领域。
试剂和器材
一、试剂
Acr－Bis贮存液：29.1g Acr,0.9g Bis, 用无离子水溶解后定容至100ml,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。
等电点标准蛋白（pH3－pH10）试剂盒，临用前稀释至0.1－0.3mg/mL。
适合于pH3－pH10范围的电极溶液：
A: 阴极电极溶液（1mol/L NaOH）:称NaOH(AR)4g，加去离子水使其溶解，冷却至室温再定容至100ml；
B: 阳极电极溶液（1mol/L H3PO4）:取H3PO4（85％）6.7ml，加去离子水定容至100ml。
固定液：称取磺基水杨酸3.5g，三氯乙酸10ml，甲醇35ml，加去离子水至100ml。
染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.1g，冰乙酸10ml，甲醇35ml，加去离子水使其完全溶解，在定容至100ml，过滤后置棕色瓶保存。
脱色液：取无水乙醇50ml，冰乙酸20ml，加蒸馏水至200ml。
保存液：取无水乙醇25ml，冰乙酸10ml, 甘油5ml，加蒸馏水至100ml。
10％过硫酸铵，TEMED, 40%两性电解质载体（pH3－pH10）。
二、材料
待测已纯化的蛋白质样品（脱盐），浓度0.5mg/mL。
三、器材
等电聚焦电泳槽, 移液管（1，5，10ml），烧杯（25，50，100ml），细长头的吸管，微量注射器（10μL或者50μL），漏斗，滤纸，镊子。
操作方法
一、准备工作
配制凝胶前，应把玻璃板准备好。即将两块干净的玻璃板叠放在一起，之间夹上所需凝胶厚度的胶条进行密封。然后用文具夹将玻璃板四周固定好。注意夹子作用力点在胶条正中，以防漏胶。
二、配制凝胶
取Acr-Bis储备液2.0ml；两性电解质0.5ml；去离子水5.5ml；TEMED 8μl置于小烧杯中混匀，再加入10% 过硫酸胺50μl，用磁力搅拌器充分混匀2min。然后用注射器吸净混合液，排除气泡，缓缓注入玻璃板的夹隙内。注意勿出现气泡。
三、电泳
1. 剥胶板 将胶板取出，揭去上层的玻璃板和胶条，然后用蒸馏水轻轻冲洗一下胶面。
2. 点样 用小纸条（0.5 cm′0.5cm）蘸样，均匀地点在胶板上，点样要求整齐、迅速。注意胶板两边要留出一定空间。通常把PI在酸性范围的样品放在偏碱性的位置（负极），PI偏酸性的样品放在偏酸性的位置（正极），标准蛋白质混合样品放在中间。
3. 进样 将浸入电极液的滤纸条取出，使其分别平直紧贴在胶面两端，然后放入电泳槽内，注意正负极相吻合。将电极板正极（电极条浸有H3PO4的一侧）与负极（电极条浸有NaOH的一侧）分别与电泳仪的正、负极连接。接通冷却水，在室温下电泳，把电泳仪调至电压50V，电流以每板胶不超过17mA为准，然后开始电泳。进样时间一般在1.5－2小时。
4. 揭样纸 待电流降至每板胶3mA以下时，切断电源，取出胶板，揭去加样纸后，将电压调至220~320V继续电泳。5. 加压 当电流降至每板胶3mA以下时，升高电压至580V，继续电泳1.5小时左右。
6. 电流降至每板3mA以下时，切断电源，停止电泳。
四、固定、，染色和脱色
将凝胶板放在培养皿中，加入固定液，浸泡数小时后，用脱色液清洗两次，每次10min, 然后加入染色液，室温下放置15－30min，再用脱色液洗脱数次，直至谱带清晰，放入保存液中浸泡10min,可制干板。
五、制作干胶板
1. 取完全浸湿的平整玻璃纸一张，于玻璃板上铺平，纸与板之间不可有气泡。
2. 将凝胶铺于上述玻璃纸上，对齐中心位置，使四边留出距离相等，随后将胶与纸之间的气泡轻轻赶跑。然后，把另一张玻璃纸折起盖在胶面上，并与下层玻璃纸对齐，胶与两层玻璃纸之间要绝对避免气泡，要求光滑平整。
3. 将凝胶四边上下两层玻璃纸贴紧，使胶边边缘上完全没有气泡。然后将各边的玻璃纸多余部分折向玻璃板反面。
4. 置于室温中自然干燥，完全干燥后的胶板，手感如触及玻璃板。这时，可将胶板揭下，裁去边角多余的纸，即可得一张图谱清晰的干胶板。
注意事项
（1）支持介质
在IEF-PAGE中，丙烯酰胺純度极为重要，Acr及Bis中如有丙烯酸，则引起聚焦后pH剃度漂移，一般需用重结晶法进一步纯化Acr及Bis。 最近Pharmacia公司推出Amberlite MB-6除去丙烯酸，其效果较再結晶法更佳。
（2）两性电解质载体
两性电解质载体是IEF-PAGE中最关键的试剂，直接影响pH梯度的形成，以及蛋白質
的聚焦。因此，要选用优质的两性电解质载体，在凝胶中，其终浓度一般为1-2%。pH梯度的线性依赖于两性电解质的性质，选择哪种pH梯度范围的两性电解质载体，則与被分离蛋白质的pI有关。
（3）样品预处理与加样方法
实验证实，盐离子可干扰pH梯度形成，并使区带扭曲。为了防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用Sephadex G-25脱盐，也可将样品溶解在水，或是低盐缓冲液中，使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。但某些蛋白质在等电点附近，或水溶液及低盐溶液中，溶解度较低，則可在样品中加入两性电解质，如加入1%甘氨酸或对1%甘氨酸透析，虽然甘氨酸是两性电解质，但不影响pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶极距作用增加蛋白質的溶解性。此外，还可在样品及凝胶溶液中加入无离子去污剂如Tween 80, Triton X-100, Nonide P-40等或加入相同浓度的尿素(4 M)，以免氰酸盐引起蛋白质的胺甲酰化，含有尿素的样品及凝胶板只能当天使用。
加样量取决于样品中蛋白质的种类、数目及检测方法的灵敏度。如用银染色，加样量可减少到1 μg。一般样品浓度以0.5-3 mg/ml为宜，最适加样体积为10-30 μl。如样品很浓，可直接在凝胶表面加2-5 μl；如样品很稀，可加样300μl。值得注意的是：对不稳定的样品可先将凝胶进行15-30 min预电泳使pH梯度形成，然后将样品放再靠近pI的位置以缩短电泳的时间，但不要将样品正好加在pI处和紧靠阳、阴极的胶面上，以免引起蛋白质变性造成区带扭曲。一般加样电泳半小时后，取出加样滤纸以免引起拖尾現象。
（4）电功率、时间等因素
在IEF电泳中，随着样品的迁移越接近pI时，电流则越来越小。为使各成分能更好
地分离，要保持一定的电功率，就应不断增加电压，电压增高可缩短pH梯度形成，和蛋白质分离所需的时间，但过高的电压会使凝胶板局部范围过热，因此，在电泳过程中，应通冷却水，水温以4-10℃为宜，流量5-10 l/min。一般宽pH范围电泳时间以1.5-2 h为宜。
